膠質(zhì)母細胞瘤特異性癌基因篩選以及癌基因FoxM1通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VEGF表達促進膠質(zhì)母細胞瘤生長及血管生成的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中楸神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，WHOIII，IV級膠質(zhì)瘤(間變性星形細胞瘤以及膠質(zhì)母細胞瘤)具有高度侵襲性，術(shù)后復發(fā)快，并對放療和化療表現(xiàn)出內(nèi)在抗性，患者預(yù)后不佳。盡管如此針對惡性膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)治療包括擴大性根治切除并輔助放療及化療等多種方式，患者一年期累積生存率仍小于30％，僅有3％的患者生存期超過5年，總平均生存時間6-9個月。多年來，針對膠質(zhì)母細胞瘤的治療方式不斷改進，但卻未能改進該病的總體預(yù)后，因此尋找和發(fā)現(xiàn)治療惡性膠質(zhì)

2、瘤更加有效的新方法已成為神經(jīng)腫瘤學研究領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。闡明惡性膠質(zhì)瘤的致病分子通路及其對抗放化療的分子基礎(chǔ)，是尋找和確認有效的治療靶點、發(fā)展合理的新綜合治療策略的關(guān)鍵。
　　 基因表達芯片是今年來新興的一項研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的技術(shù)。利用基因表達芯片技術(shù)，通過比對惡性膠質(zhì)瘤患者的腫瘤樣品總mRNA以及非腫瘤患者的腦組織樣本總mRNA，我們希望篩選出惡性膠質(zhì)瘤患者特異性表達的癌基因標志物，并研究其導致惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，

3、希望發(fā)現(xiàn)將來治療的新靶點。通過基因芯片，我們篩選出一系列在惡性膠質(zhì)瘤中特異性高表達的癌基因，包括AEG-1(Astrocyte Elevate Gene-1)，SPHK1( Sphingosine Kinase-1)，F(xiàn)oxM1(Forkhead Transcription Factor M1)，VEGF(vascular endothelialgrowth factor)等。在大樣本的乳腺癌標本以及惡性膠質(zhì)瘤標本的研究中發(fā)現(xiàn)，AEG-

4、1,SPHK1,FoxM1等癌基因表達水平和腫瘤分級，患者生存期呈高度負相關(guān)，可作為新的檢測腫瘤發(fā)生的早期標志物以及作為腫瘤患者預(yù)后判定的標志物。同時，我們深入研究了FoxM1通過調(diào)控VEGF基因?qū)е聬盒阅z質(zhì)瘤發(fā)生中的具體分子機制。
　　 新生血管和缺氧性酸中毒是包括惡性膠質(zhì)瘤在內(nèi)的實體性腫瘤形成的標志性指標。vascular endothelialgrowth factor(VEGF)是最重要的導致新生血管形成的生長因子之一。

5、作為血管通透性和新生血管早期誘導因子，VEGF在惡性膠質(zhì)瘤中表達極高并對惡性膠質(zhì)瘤的快速生長和浸潤起到重要的作用。目前認為，缺氧和酸中毒均為誘導VEGF的表達的重要因素，包括通過HIF-1(hypoxia inducefactor-1)等導致的VEGF高表達；同時VEGF表達也受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，例如STAT3(signal transducer and activator of transcription3)等。研究表明，HI

6、F-1在腫瘤內(nèi)部缺氧的環(huán)境下表達增高，并直接作用于VEGF基因的啟動子，誘導VEGF基因mRNA表達。然而，在惡性膠質(zhì)瘤中，VEGF增高也常見于腫瘤浸潤正常組織的邊緣，而這些邊緣部位并無十分明顯的缺氧環(huán)境。與此同時，在某些含氧量趨于正常的惡性膠質(zhì)瘤細胞系中也可以檢測到過量表達的VEGF。此外，STAT3誘導VEGF表達也頗具爭議，目前的公認意見傾向于STAT3對VEGF的作用決定于腫瘤本身的遺傳背景。例如報道指出，在某些惡性膠質(zhì)瘤細胞系

7、中，STAT3的表達可以促進體外腫瘤的存活，而其他的報道則指出在STAT3另一些惡性膠質(zhì)瘤中則基本無表達。在VEGF對惡性膠質(zhì)瘤的作用十分明確的前提下，研究其他導致惡性膠質(zhì)瘤中VEGF增高的原因顯得十分必要。
　　 FoxM1(Forkhead Transcription Factor M1)屬于Fork Head(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族，在細胞周期G2/M期調(diào)控有重要作用。FoxM1在細胞進入G2期時表達量急劇增加，在細胞進入M

8、期后立即降解，對保持細胞分裂過程的順利進行起著精確的調(diào)控作用。FoxM1的異常表達可以導致細胞分裂加速.生長失去控制而引起腫瘤發(fā)生。前期報道顯示，在多種實體性惡性腫瘤，包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，肺癌和大腸癌等中FoxM1均有不同程度的高表達。最近，兩則獨立研究報道顯示FoxM1在惡性膠質(zhì)瘤中也有明顯的增加。Dr.Huang實驗室的研究表明，F(xiàn)oxM1是膠質(zhì)瘤中主要表達的FoxM1蛋白，并且FoxM1在正常腦組織中未見表達。此外，F(xiàn)ox

9、M1的表達和惡性膠質(zhì)瘤的分級高度正相關(guān)，并且和患者的生存期高度負相關(guān)。在動物模型中，增加FoxM1的表達導致膠質(zhì)瘤細胞的致瘤性和侵襲性增加。在間變性星形細胞瘤細胞中過表達FoxM1,可以在試驗動物體內(nèi)形成高度惡性并伴高度新生血管生成的膠質(zhì)母細胞瘤。這提示我們FoxM1對腫瘤的血管生成起著重要的作用。
　　 本課題研究中，我們提取了60例惡性膠質(zhì)瘤患者的手術(shù)腫瘤標本總mRNA以及20例非腫瘤患者的手術(shù)標本總mRNA，利用基因表達芯

10、片技術(shù)，我們分析了腫瘤患者和非腫瘤患者間的mRNA表達差異，篩選出一系列的在惡性膠質(zhì)瘤中高特異性高表達的癌基因。在這些癌基因中，我們選擇了AEG-1,SPHK1以及FoxM1進行研究。通過大樣本的乳腺癌標本(225例)的免疫組化染色證明，AEG-1在腫瘤中高表達，并且和腫瘤的分級以及患者預(yù)后高度負相關(guān)。在大樣本的膠質(zhì)瘤標本(243例)中的免疫組化染色證實，SPHK1也和腫瘤分級以及預(yù)后高度負相關(guān)。接下來，我們在膠質(zhì)瘤細胞系和乳腺癌細胞系

11、中的研究發(fā)現(xiàn)，AEG-1和SPHK1在蛋白水平和mRNA水平與正常細胞相比呈高表達，并且在患者樣本中證實了以上結(jié)果。通過我們的研究表明，AEG-1和SPHK1均可以作為腫瘤發(fā)生的早期診斷指標，并可以作為預(yù)期的治療靶點。
　　 FoxM1作為另外一個篩選出的癌基因，已有研究表明其在惡性膠質(zhì)瘤中高表達，并與患者預(yù)后以及生存期高度負相關(guān)。為了研究FoxM1和VEGF在導致惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生的具體機制，我們闡明FoxM1以及VEGF在人腦膠

12、質(zhì)瘤中的表達狀況，從而了解FoxM1,VEGF與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的相關(guān)性；繼而闡明FoxM1調(diào)節(jié)VEGF的具體分子機制，最后在動物模型中驗證FoxM1調(diào)節(jié)VEGF導致腫瘤形成。我們首先比較FoM1和VEGF在低級別膠質(zhì)瘤，間變性星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤患者標本中的表達，F(xiàn)oxM1表達和VEGF表達呈高度正相關(guān)。利用免疫組化檢測膠質(zhì)母細胞瘤石蠟包埋切片59例，我們發(fā)現(xiàn)VEGF表達不僅局限于腫瘤中心缺氧部位，并且在腫瘤浸潤邊緣也十分明顯。

13、然而，在擴大切除標本中相對“正常”的腦組織中并無VEGF表達。統(tǒng)計表明，F(xiàn)oxM1表達和VEGF表達程度高度相關(guān)(r=0.79，p<0.001)。類似的相關(guān)性結(jié)果也在間變性星形細胞瘤中觀察到(r=0.75，p<0.001)。同時在冰凍切片中通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞核內(nèi)FoxM1表達高的細胞，包漿以及周圍表達VEGF含量也相應(yīng)增高。不同級別的膠質(zhì)瘤標本蛋白水平顯示，F(xiàn)oxM1表達水平和VEGF表達水平高度相關(guān)。為了闡明FoxM1調(diào)節(jié)

14、VEGF的分子機制，我們建立了FoxM1穩(wěn)定過表達的兩株間變性星形細胞瘤細胞株SW1783-FoxM1以及HS683-FoxM1,同時建立了兩株FoxM1穩(wěn)定沉默的膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87-FoxM1shRNA以及U251-FoxM1shRNA，在體外試驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達FoxM1可以在SW1783和HS683細胞水平增加VEGFmRNA和蛋白水平的表達，而通過RNAi沉默F(xiàn)oxM1則降低了U87和U251細胞株中VEGFmRNA和蛋白水

15、平的表達。為了研究FoxM1調(diào)控VEGF表達的機制，我們克隆了VEGF的啟動子，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)證明了FoxM1可以直接激活VEGF的啟動子。進而，我們通過點突變技術(shù)改變了VEGF啟動子上FoxM1結(jié)合的關(guān)鍵位點的序列，發(fā)現(xiàn)FoxM1無法激活突變的VEGF啟動子。從而證明了FoxM1的結(jié)合位點對于VEGF的激活具有關(guān)鍵性的作用。同時我們運用了CHIP技術(shù)，在細胞內(nèi)證實了FoxM1結(jié)合到VEGF啟動子區(qū)域的特異性結(jié)合位點。為了證明F

16、oxM1和VEGF啟動子的直接結(jié)合，我們采用EMSA技術(shù)，使用磷32放射性標記證明FoxM1在體外可以和VEGF啟動子上特異性的FoxM1識別位點完全結(jié)合。Super Shfit試驗表明，F(xiàn)oxM1和VEGF啟動子的結(jié)合具有特異性。最后，為了在體內(nèi)試驗證明FoxM1調(diào)節(jié)VEGF表達，我們在裸鼠試驗中采用原位注射的方式，直接誘導裸鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤。在動物模型試驗中我們發(fā)現(xiàn)，U251和U87細胞原位注射誘導裸鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤的成功率為100％，(5