芹菜素調(diào)控IKK-β介導(dǎo)的NF-κB活化并抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng).pdf

1、目的：
　　胰腺癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，全世界因罹患惡性腫瘤致死的病例中，胰腺癌在死亡原因中排第四位。在我國，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率也是逐年升高。胰腺癌是一種具有高度侵襲性的疾病，當(dāng)其被確診時(shí)常常已進(jìn)展至晚期，預(yù)后不良。盡管在化療和放療領(lǐng)域已取得了顯著的進(jìn)展，但是很多胰腺癌患者的療效仍然不佳，有的病例甚至產(chǎn)生了對(duì)化療或放療的抵抗。鑒于此，研究開發(fā)更為有效的胰腺癌治療策略就顯得尤為必要了。
　　研究表明，芹菜素（4，

2、5，7-三羥基黃酮）是一種在蔬菜和水果中普遍存在的膳食類黃酮化合物，同時(shí)也是一類具有潛在防癌作用的藥劑，它對(duì)于胰腺癌的預(yù)防和治療具有積極作用。很多研究表明，芹菜素抑制了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和血管新生，比如:芹菜素對(duì)惡性黑色素瘤、乳腺癌、皮膚癌、胰腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞均有抑制作用。芹菜素的這些作用主要是通過抑制環(huán)氧合酶-2（COX-2），基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、一氧化氮合酶（NOS-2層2）和脂肪氧合酶等來實(shí)現(xiàn)的，而這些酶都受到NF

3、-κB的調(diào)節(jié)。因此我們推測(cè)，芹菜素是通過調(diào)控NF-κB的活化，來對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮抑制作用的。
　　NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，與其抑制分子IκB家族相結(jié)合處于非活化狀態(tài)，存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)各種刺激（比如:炎癥細(xì)胞因子、細(xì)菌或病毒產(chǎn)物、各種類型的應(yīng)激等）作用于細(xì)胞時(shí)，IκB分子就會(huì)在兩個(gè)關(guān)鍵的絲氨酸殘基位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，繼而發(fā)生聚泛素化并被蛋白酶體降解。與IκB解離后的游離NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，激活了相應(yīng)靶基因的

4、轉(zhuǎn)錄。NF-κB調(diào)控的靶基因多種多樣，涉及到了免疫及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)調(diào)控、抗凋亡等作用范圍。
　　我們的研究目的:因?yàn)榍叭说难芯勘砻鬓D(zhuǎn)錄因子NF-κ B在胰腺癌中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，所以在研究芹菜素抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制時(shí)，我們?nèi)赃x取了NF-κB作為主要研究對(duì)象并試圖弄清它所扮演的角色。我們希望闡明芹菜素是如何調(diào)控NF-κB活化，進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　方法：
　　1、芹菜素與細(xì)胞系
　　

5、芹菜素購買自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，加入細(xì)胞培養(yǎng)基前先溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。人胰腺癌細(xì)胞系購買自美國模式培養(yǎng)物收藏庫(American Type CultureCollection，ATCC)，所有細(xì)胞系均培養(yǎng)在含有5％CO2、恒溫37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基采用加入了10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　2、細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定
　　采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。細(xì)胞加入1mg/

6、ml的MTT孵育3小時(shí)，隨后溶解于DMSO中。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各個(gè)樣本的吸光度(Absorbance，A)，計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率。
　　3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　細(xì)胞凋亡采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞先用芹菜素處理，然后用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（AnnexinⅤ/PI）染色，染色步驟按照AnnexinⅤ/PI檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行規(guī)范操作。染色完成后，將標(biāo)本用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　4、半胱天冬酶-3(caspas

7、e-3)活性測(cè)定
　　按照caspase-3活性檢測(cè)試劑盒的操作說明，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀對(duì)細(xì)胞裂解物中caspase-3的活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　5、轉(zhuǎn)染與熒光素酶檢測(cè)
　　使用脂質(zhì)體2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，采用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。
　　6、Western蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)
　　收集處理完成的細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度，使每個(gè)樣品上樣的總蛋白量相同。使用10

8、％SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，隨后再將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。選擇β-actin抗體作為內(nèi)參抗體以判斷各樣品的上樣量是否一致。
　　7、電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)
　　為了確定NF-κB的活化情況，用提取的細(xì)胞核蛋白進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)，NF-κB的DNA共有序列購買自Santa Cruz Biotechnology。使用100倍未標(biāo)記的DNA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)結(jié)合的特異性。針對(duì)p65和p50的抗體被用來進(jìn)行超

9、級(jí)遷移率變動(dòng)試驗(yàn)。DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物存在于4％聚丙烯酰胺凝膠上，通過放射自顯影進(jìn)行觀察分析。
　　8、體外IKK-β激酶活性測(cè)定與腺病毒感染
　　使用HTScan IKK-β激酶檢測(cè)試劑盒(Cell Signaling Technology)測(cè)定IKK-β激酶的活性。
　　為了使IKK-β過表達(dá)，我們使用β-半乳糖苷酶或野生型IKK-β腺病毒感染細(xì)胞，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)后設(shè)定感染復(fù)數(shù)(MOI)為50，感染時(shí)間為24小時(shí)，感

10、染效率可達(dá)到80％～90％左右。
　　9、裸鼠移植瘤模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　使用4周大的BALB/c雌性裸鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將AsPC-1胰腺癌細(xì)胞（大約5×106個(gè)）注射入裸鼠皮下以形成異種移植瘤。裸鼠被隨機(jī)分為3組（每組6只）:對(duì)照組、芹菜素1組（15mg/kg）和芹菜素2組(30mg/kg)。芹菜素溶解于0.2ml含有0.5％甲基纖維素和0.025％吐溫20的溶劑中。在長(zhǎng)出可觸及的腫瘤(體積大約50-100mm3)后，芹菜素1

11、組和2組的裸鼠按照設(shè)定的用藥量每天灌胃，直至滿6周為止。對(duì)照組僅接受0.2ml的單純?nèi)軇ê?.5％甲基纖維素和0.025％吐溫20）灌胃。腫瘤的大小每周測(cè)兩次，并通過公式:體積=寬度2×長(zhǎng)度/2，計(jì)算每只裸鼠的成瘤體積。6周后將裸鼠處死，并取出相應(yīng)的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)的Westem蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。
　　10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS軟件完成。計(jì)量資料使用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用雙側(cè)Stude

12、nt t檢驗(yàn)判斷各組間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異，顯著性水準(zhǔn)為:P＜0.05或P＜0.01。
　　結(jié)果：
　　1、芹菜素以一種濃度依賴的模式抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，AsPC-1、Panc-1和MiaPaCa-2三種胰腺癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50值）分別為:28.5uM、46.8uM和60.7uM。此外，芹菜素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生了凋亡，而不是發(fā)生壞死。在胰腺癌細(xì)胞中，芹菜素以一種濃度依賴的模式誘導(dǎo)了caspase-3的

13、活化，并且導(dǎo)致了PARP發(fā)生剪切。
　　2、使用濃度為10ng/ml的TNF-α預(yù)處理AsPC-1胰腺癌細(xì)胞3小時(shí)，用EMSA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NF-κB的DNA結(jié)合活性明顯升高，然而，將AsPC-1胰腺癌細(xì)胞用濃度為40uM的芹菜素預(yù)培養(yǎng)6小時(shí)，可以明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的DNA結(jié)合活性。此外，芹菜素預(yù)培養(yǎng)也降低了AsPC-1胰腺癌細(xì)胞中NF-κB基礎(chǔ)狀態(tài)的DNA結(jié)合活性。
　　3、芹菜素既能降低AsPC-1胰腺癌細(xì)胞基

14、礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，又能降低TNF-α誘導(dǎo)后NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。濃度為10ng/ml的TNF-α即可刺激AsPC-1胰腺癌細(xì)胞中p65和p50的核易位，然而使用濃度為40uM的芹菜素預(yù)培養(yǎng)可以顯著地預(yù)防這一過程的發(fā)生。在用TNF-α處理過3小時(shí)的AsPC-1胰腺癌細(xì)胞中，使用芹菜素可以顯著地抑制IκB-α的降解和磷酸化。此外，芹菜素也能略微地減少細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)水平的p65和p50核易位以及IκB-α降解。
　　4、使用濃度

15、為40uM的芹菜素預(yù)培養(yǎng)6小時(shí)，可以適度地抑制TNF-α誘導(dǎo)的IKK-β表達(dá)，但是卻沒有改變IKK-α的表達(dá)水平。芹菜素也能顯著地降低IKK-β的磷酸化水平和IKK-β激酶活性。
　　5、IKK的抑制劑Bay11-7082能夠增強(qiáng)芹菜素對(duì)AsPC-1胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。此外，聯(lián)用芹菜素和Bay11-7082處理細(xì)胞24小時(shí)還能增加PARP的剪切。這些結(jié)果均提示:抑制或阻斷IKK能夠有效地增強(qiáng)芹菜素對(duì)胰腺癌的抗癌功效。

16、　　6、IKK-β過表達(dá)顯著地減弱了芹菜素對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，這從另一個(gè)角度提示:抑制IKK-β的活化將有助于芹菜素發(fā)揮對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　7、在裸鼠移植瘤模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用30mg/kg劑量的芹菜素可以有效縮小腫瘤的體積，該作用從用藥4周時(shí)開始持續(xù)至用藥6周終止時(shí)。在此過程中，所有接受芹菜素治療的裸鼠均未出現(xiàn)任何中毒的征象。另一方面，與對(duì)照組相比，芹菜素組還能明顯減少IKK-β的表達(dá)和活化，進(jìn)一步證實(shí)

17、了體外實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。對(duì)于細(xì)胞凋亡作用方面，使用Western蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素組增加了PARP和caspase-3的剪切，這證明芹菜素對(duì)裸鼠移植瘤模型的治療作用，至少部分是通過誘導(dǎo)凋亡來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　研究發(fā)現(xiàn):芹菜素抑制了胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡;在NF-κB的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性方面，芹菜素既能降低NF-κB的基礎(chǔ)活性，又能降低TNF-α誘導(dǎo)后的NF-κB活性;芹菜素也能抑制IκB-α的磷酸