去甲斑蝥素影響胰腺癌細(xì)胞生長的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、胰腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤,發(fā)病率高,預(yù)后差。目前尚無完全可靠有效的治療方法。已知腫瘤是一種細(xì)胞增殖與死亡障礙性疾病,腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制失常在惡性腫瘤的演進(jìn)過程中起重要作用。腫瘤防治的關(guān)鍵手段之一就是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究探討傳統(tǒng)中藥的提取物去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)對人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長的相關(guān)凋亡基因Bcl-2、Caspase-3的影響變化情況,尋求其

2、作用效果及機制。 材料和方法: 1.人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞購自第四軍醫(yī)大學(xué)。去甲斑蝥素(norcan-tharidin,NCTD)由沈陽藥科大學(xué)趙明宏博士饋贈。流式細(xì)胞儀:美國Bec-ton Dickinson公司產(chǎn)的熒光激活分選儀(FACS)420型。免疫組化鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人Caspase-3抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。圖像分析儀器型號:MetaMorph/DPIO/BX41;生產(chǎn)廠:UIC/OL

3、YMPUS,US/JP。圖象分析軟件:1 D Kodar成像分析系統(tǒng)。 2.培養(yǎng)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株并傳代。 3.體外細(xì)胞殺傷實驗:①以NCTD濃度為橫軸、吸光值為縱軸,繪制藥物濃度曲線,求50%抑制率對應(yīng)的藥物濃度即為半數(shù)抑制濃度IC50。②NCTD對AsPC-1細(xì)胞的抑制率為:抑制率=(l-實驗組A值/對照組A值)×100%。找出NCTD抑制作用最明顯的時間。 4.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:①一般形態(tài)學(xué)觀察。②超

4、微結(jié)構(gòu)觀察。 5.流式細(xì)胞術(shù):檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率。 6.Western blot:分別收集對照組(n=6)和實驗組(n=6)胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行Western blot實驗。以β-actin為內(nèi)對照。照片用1D Kodar圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值半定量分析,以相應(yīng)蛋白條帶的平均光密度值來表示Capase-3的表達(dá)程度。 7.胰腺癌裸鼠模型建立,裸鼠種植瘤生長抑制實驗:荷瘤鼠隨機分成對照組(n=8)、NCTD組

5、(n=8)、5-FU組(n=8)、NCTD+5-FU聯(lián)合用藥組(n=8)4組,各組用藥前裸鼠體重和瘤體大小無差異。從種植AsPC-1細(xì)胞后第2周始,分別自腹腔注射生理鹽水、5-FU(24mg/kg,)、NCTD(28mg/kg)、5-FU(24mg/kg)+NCTD(28mg/kg),每周2次,共6周。 8.荷瘤裸鼠標(biāo)本免疫組化處理:荷瘤鼠隨機分成對照組(n=8)、NCTD組(n=8)。用藥前2組裸鼠體重和瘤體大小無差異。從種植

6、AsPC-1細(xì)胞后第2周始,分別自腹腔注射生理鹽水、NCTD(28mg/kg,每周2次,共6周。待第7周以頸椎脫位法處死裸鼠,切取種植瘤標(biāo)本固定、切片。 Bcl-2免疫組化處理,封片后在光鏡下觀察。根據(jù)細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃染物質(zhì)的光密度判讀結(jié)果,隨機框取相同放大倍數(shù)與面積的細(xì)胞區(qū)域,采用MetaMor-ph/DP10/BX41型圖象分析系統(tǒng)測定其相對光密度。 結(jié)果: 1.NCTD濃度為10μg/ml時,對AsPC-1

7、的生長有抑制作用,且隨藥物濃度升高其抑制作用增強,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系;NCTD作用6h后對AsPC-1生長具有抑制作用,48 h時抑制作用最明顯,呈時間-效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)NCTD作用后,流式細(xì)胞儀顯示:G2+M期的細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞凋亡率上升;光鏡檢查顯示:AsPC-1可出現(xiàn)細(xì)胞固縮,胞膜突出,核碎裂等現(xiàn)象;電鏡顯示:細(xì)胞微絨毛卷縮、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器衰退,并可見典型的凋亡小體。 2.20μg/ml的NCTD液

8、作用于體外培養(yǎng)的人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48h.Western blot分析顯示實驗組Caspase-3的表達(dá)顯著增加(P<0.05);裸鼠移植瘤切片經(jīng)免疫組化分析,實驗組Bc1-2的表達(dá)顯著減少(P<0.01)。 3.NCTD可使裸鼠種植瘤明顯縮小(2.22±0.18 Vs.3.25±0.18 cm3,P<0.01),抑瘤率增高(31.69%vs.0,P<0.05);種植瘤細(xì)胞周期中G2+M期細(xì)胞百分率明顯增多(51.24±1

9、.92 Vs.23.31±1.81,P<0.01),凋亡率上升(0.23±0.05 vs.4.21±0.52,P<0.01);與5-FU合用時上述作用更明顯。NCTD作用后的種植瘤細(xì)胞經(jīng)光鏡檢查見胞核固縮,核碎裂等現(xiàn)象;電鏡顯示典型的凋亡細(xì)胞及凋亡小體。 結(jié)論: 1.NCTD能抑制人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的生長,其作用呈劑量、時間-效應(yīng)關(guān)系。其機制可能與NCTD誘導(dǎo)AsPC-1細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖,干擾細(xì)胞生長周期,抑

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