MiR-221促進胰腺癌細胞自吞噬并靶向調(diào)控c-Fos抑制胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制研究.pdf

1、目的：胰腺癌是一種惡性程度極高、預后差的惡性腫瘤。其具有早期診斷率低，早期即發(fā)生原位及遠處轉(zhuǎn)移等特點.而胰腺癌細胞的高度侵襲和轉(zhuǎn)移特性是胰腺癌預后較差的重要原因之一。胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制目前尚未完全闡明。為改善胰腺癌預后，針對胰腺癌的高度侵襲轉(zhuǎn)移特性，開發(fā)抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的特異性分子靶向治療方法，從而改善胰腺癌患者的預后，是亟待解決的主要問題。MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為18-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，

2、作用于多種信使RNA(mRNA)，導致信使RNA的翻譯抑制或降解。越來越多的研究表明，microRNA可通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲，轉(zhuǎn)移，凋亡，增殖，自吞噬等，在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，診斷，預后和治療中扮演至關(guān)重要的作用。在前期研究中，我們利用倉鼠低侵襲株(PC-1)和移植后早期高頻率發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的高侵襲株(PC-1.0)胰腺癌細胞，進行了microRNA的差異性表達比較研究。我們的前期研究證實，對比低侵襲性胰腺癌細胞，miR-221在高侵襲性胰

3、腺癌細胞中穩(wěn)定低表達。然而，miR-221是否作用于胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移作用有待研究。本實驗的目的寄深入探討miR-221在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，及其可能的分子機制。并探討miR-221是否可以調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的自吞噬功能，以及其可能的作用機制。
　　方法：利用細胞形態(tài)學實驗，驗證過表達miR-221是否調(diào)控胰腺癌細胞的形態(tài)改變。利用Wound Healing遷移實驗，驗證過表達miR-221是否調(diào)控胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)移功能。利用

4、Transwell侵襲實驗，驗證過表達miR-221是否調(diào)控胰腺癌細胞的侵襲功能。在前期研究中，通過生物學預測網(wǎng)站，我們預測c-Fos可能為miR-221調(diào)控的下游靶基因。本次試驗中，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實c-Fos是否為miR-221的直接調(diào)控的下游靶基因。并利用Western Blotting驗證miR-221對于c-Fos蛋白表達的調(diào)控作用。而后，利用Wound Healing遷移實驗，驗證抑制c-Fos蛋白表達是否調(diào)控胰腺

5、癌細胞的轉(zhuǎn)移功能。利用Transwell侵襲實驗，驗證驗證抑制c-Fos蛋白表達是否調(diào)控胰腺癌細胞的侵襲功能。并利用Western Blotting驗證c-Fos對金屬基質(zhì)蛋白酶7（MMP-7）蛋白的表達的調(diào)控作用。從而揭示miR-221是否可以通過靶向調(diào)控c-Fos，調(diào)控胰腺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移功能。利用Western Blotting驗證過表達miR-221是否調(diào)控胰腺癌細胞的自吞噬功能。利用Western Blotting驗證過表達

6、miR-221是否調(diào)控組蛋白去乙?；?(HDAC6)蛋白表達。利用免疫熒光染色實驗，驗證抑制HDAC6蛋白表達是否調(diào)控胰腺癌細胞的自吞噬功能。從而闡述miR-221調(diào)控胰腺癌細胞自吞噬的可能機制。
　　結(jié)果：通常情況下，PC-1.0和AsPC-1細胞呈單細胞方式生長，然而，在上調(diào)miR-221的表達后，細胞生長方式由單細胞方式生長轉(zhuǎn)變?yōu)閸u樣克隆樣生長，miR-221可誘導細胞形態(tài)學變化。Wound Healing轉(zhuǎn)移實驗證實，在

7、上調(diào)miR-221的表達后，胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力下調(diào)。同時，Transwell侵襲實驗證實，在上調(diào)miR-221的表達后，胰腺癌細胞侵襲能力明顯下調(diào)。表明miR-221可抑制胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移功能。雙熒光素酶報告實驗證實，c-Fos為miR-221的下游靶基因，并受miR-221反向調(diào)節(jié)。Western Blotting驗證了雙熒光素酶報告實驗的結(jié)果，上調(diào)miR-221的表達后，胰腺癌細胞中c-Fos蛋白的表達量明顯下調(diào)。Wound

8、Healing轉(zhuǎn)移實驗證實，在抑制c-Fos的表達后，胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力下調(diào)。同時，Transwell侵襲實驗證實，在抑制c-Fos的表達后，胰腺癌細胞侵襲能力明顯下調(diào)。我們的實驗結(jié)果證實，下調(diào)c-Fos的表達后，胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制。因此，miR-221對于胰腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控可能是通過調(diào)控c-Fos的表達來實現(xiàn)的。與此同時，下調(diào)c-Fos表達可抑制MMP-7蛋白表達。證實了miR-221可能通過反向靶向調(diào)

9、節(jié)c-Fos，進而調(diào)節(jié)MMP-7蛋白表達，從而達到調(diào)控胰腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。Western Blotting實驗結(jié)果表明，過表達miR-221后，胰腺癌細胞LC3蛋白表達上調(diào)，miR-221可調(diào)控胰腺癌細胞的自吞噬功能。同時，Western Blotting實驗結(jié)果表明，過表達miR-221后，胰腺癌細胞HDAC6蛋白表達受到抑制。免疫熒光染色實驗證明，抑制胰腺癌細胞中HDAC6表達后，LC3在胰腺癌細胞胞質(zhì)中的含量顯著上調(diào)。以上