幾種蜘蛛毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、敬釗纓毛蛛(Chilobrachysjingzhao)是最近在我國海南省發(fā)現(xiàn)的一種蜘蛛新種。通過陽離子交換與反相高效液相色譜層析，從該蜘蛛粗毒中純化到兩種新組分，并分別命名為敬釗纓毛蛛毒素-V(Jingzhaotoxin-Ⅴ)和敬釗去整合素-Ⅰ(Jingzhaotin-Ⅰ)。MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定和Edman降解測序結(jié)果表明：JZTX-Ⅴ的分子量為3605.73Da，含有29個氨基酸殘基；而Jingzhaotin-Ⅰ的分子量為363

2、1.42Da，含有34個氨基酸殘基。本文還采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)法獲得了它們的全長cDNA序列，并由此推測出JZTX-Ⅴ和Jingzhaotin-Ⅰ的前體分別含有83和66個氨基酸殘基。為了更好的了解它們的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，利用同源模建技術(shù)模建了敬釗纓毛蛛毒素-Ⅴ和敬釗去整合素-Ⅰ分子的三維結(jié)構(gòu)。Jingzhaotin-Ⅰ是首次報道源于蜘蛛粗毒的一個含有KGD序列的去整合素。該肽擁有抗凝血活性，能夠抑制ADP誘導(dǎo)的人血小板

3、的聚集。在較低濃度時它能促進(jìn)人的血小板聚集，而較高濃度時則抑制血小板聚集，進(jìn)一步推測它的作用位點(diǎn)可能是血小板糖蛋白受體Ⅱb/Ⅲa。膜片鉗和電壓鉗實驗表明，JZTX-Ⅴ能夠抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞上的TTX不敏感型以及TTX敏感型鈉通道，其IC50值分別是19.8和35.4nM。JZTX-Ⅴ對處于靜息關(guān)閉與失活狀態(tài)的TTX不敏感型與TTX敏感型鈉通道均表現(xiàn)出非常高的親和性。JZTX-Ⅴ能夠抑制外源表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞上的Kv4.

4、2鉀通道(IC50值為604.2nM)，但對表達(dá)的Kv1.2、Kv1.3和Kv1.4鉀通道卻沒有影響。JZTX-Ⅴ能夠引起TTX不敏感型與TTX敏感型鈉通道的起始激活電壓或最大峰值電流激活電壓分別往去極化方向漂移約10mV,而它們的半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓卻往超極化方向漂移約7mV。單層小脂質(zhì)體的離心共沉淀實驗顯示，JZTX-Ⅴ與磷脂膜的結(jié)合需要帶負(fù)電荷的磷脂。色氨酸熒光測定與丙烯酰胺熒光淬滅實驗提示，JZTX-Ⅴ與脂質(zhì)體結(jié)合會導(dǎo)致該分子疏水表

5、面上的色氨酸殘基與水溶性的接觸減少，JZTX-Ⅴ與帶負(fù)電荷的磷脂膜結(jié)合能夠產(chǎn)生約5.7nm的紅移激發(fā)漂移。目前的研究結(jié)果暗示：當(dāng)結(jié)合到磷脂膜上的時候，JZTX-Ⅴ分子可能是處在介于磷脂膜疏水相與極性頭部分子之間的界面區(qū)域。采用Fmoc法全化學(xué)合成了JZTX-Ⅴ的四個單殘基突變體(K27A-JZTX-VR26A-JZTX-VK22A-JZTX-Ⅴ和R20VJZTX-Ⅴ)，并探索最優(yōu)的氧化還原復(fù)性條件進(jìn)行了成功復(fù)性。鑒于人的TTX-不敏感型

6、鈉通道可能是治療疼痛且副作用極少的作用靶點(diǎn)，也突出了JZTX-Ⅴ作為研究鎮(zhèn)痛藥物先導(dǎo)化合物的重要性。 應(yīng)用二維1H-NMR研究技術(shù)，識別出JZTX-Ⅰ全部33個氨基酸殘基的自旋體系，完成了序列專一的譜峰歸屬，確認(rèn)了除Gln4外的所有主鏈質(zhì)子和大于95％的側(cè)鏈質(zhì)子的化學(xué)位移。同時確定JZTX-Ⅰ的二級結(jié)構(gòu)是由三鏈反平行的β-折疊(Trp7-Cys9，Phe20-Lys23，和Leu28-Trp31)組成。單層小脂質(zhì)體的離心共沉淀實

7、驗顯示，JZTX-Ⅰ與磷脂膜的結(jié)合不需要帶負(fù)電荷的磷脂。色氨酸熒光測定與丙烯酰胺熒光淬滅實驗提示，JZTX-Ⅰ與脂質(zhì)體結(jié)合會導(dǎo)致該分子疏水表面上的色氨酸殘基與水溶性的接觸減少，而JZTX-Ⅴ與中性、帶負(fù)電荷的磷脂膜結(jié)合能夠分別產(chǎn)生約8.0和7.4nm的紅移激發(fā)漂移。與JZTX-Ⅰ不同，鈉通道位點(diǎn)3毒素BMKM1沒有磷脂膜結(jié)合活性，由此推斷JZTX-Ⅰ的作用機(jī)制可能與至今已經(jīng)報道的位點(diǎn)3毒素不同。 RVTXs是從雷氏大疣蛛粗毒中純

8、化到的新型神經(jīng)毒素。RVTX-Ⅰ和RVTX-Ⅲ分別由43和29個氨基酸殘基組成，分子量分別為4840.11和3286.58Da。這兩種毒素都能使小鼠致死和阻斷離體小鼠膈神經(jīng)膈肌標(biāo)本的神經(jīng)肌肉接頭傳遞作用。雷氏大疣蛛毒素-Ⅰ對小鼠的半致死劑量是0.772mg/kg，同時能使由電刺激引起的膈神經(jīng)膈肌的收縮產(chǎn)生先增強(qiáng)后抑制的效應(yīng)，而雷氏大疣蛛毒素-Ⅲ卻不能。膜片鉗實驗顯示RVTZ-Ⅰ既能夠延緩DRG神經(jīng)元細(xì)胞上TTX-S型鈉通道的快速失活，也

9、能夠抑制鈉通道的峰電流，而RVTX-Ⅲ卻能夠抑制DRG細(xì)胞的高域值鈣通道。RVTX-Ⅱs是一組天然突變體，分別由34、33、34個氨基酸殘基組成，分子量分別為3133.48，3020.35和3115.63Da。結(jié)合TCEP部分還原修飾和氨基酸序列測定技術(shù)，鑒定出RVTX-ⅡA的6個Cys能夠以Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅵ的連接方式形成3對二硫鍵。RVTX-ⅡLA、RVTX-ⅡB能使對綠螽斯幼蟲致死，其LD50值分別為17.99和54.95nm