炭疽毒素受體的組織分布和活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、目前已確認(rèn)炭疽毒素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上有兩種天然受體CMG2與TEM8，但是這兩種受體在體內(nèi)的天然功能，以及在不同組織的分布還不十分清楚。已有的研究表明，CMG2與炭疽保護(hù)性抗原PA的親合力比TEM8大的多，重組表達(dá)CMG2胞外區(qū)比重組表達(dá)TEM8胞外區(qū)的細(xì)胞保護(hù)活性高一百多倍，究竟CMG2是起主要作用的受體，還是TEM8是主要受體，或兩者同樣重要，也是未知。弄清兩者的組織分布和分子結(jié)構(gòu)上的差異將為正確理解毒素致病機(jī)理與設(shè)計(jì)新型毒素抑制劑提

2、供依據(jù)。 為了解炭疽毒素受體的組織分布，本研究制備了兩種受體的單克隆抗體，獲得了針對CMG2的單克隆抗體485和4G3，針對TEM8的單克隆抗體2D6和489，以及可同時(shí)結(jié)合兩者的單克隆抗體2G4，其中485還具有一定的細(xì)胞保護(hù)活性。經(jīng)鑒定485和2D6可用于ATR體內(nèi)外分布的檢測，在對小鼠的9個(gè)組織器官進(jìn)行了Western blotting和免疫組化檢測后發(fā)現(xiàn)，CMG2和TEM8廣泛分布于各組織器官，在一些關(guān)鍵的組織中有明顯的

3、差別，不能確定兩種受體在機(jī)體內(nèi)的分布誰強(qiáng)誰弱，但是在分布上的差異可能暗示了在不同的炭疽感染途徑中是不同的受體在起作用，肺炭疽時(shí)可能CMG2和TEM8均起作用，皮膚炭疽和腸炭疽時(shí)則可能是TEM8為主。 出于探索炭疽毒素受體的結(jié)構(gòu)與功能，本研究還用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)克隆表達(dá)了六個(gè)CMG2胞外區(qū)截短片段，經(jīng)蛋白純化后，進(jìn)行了Western blotting和細(xì)胞保護(hù)性實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果顯示六個(gè)截短的CMG2蛋白均可與485單抗結(jié)合，其中CM

4、G2(40-133)、CMG2(40-159)、CMG2(40-186)和CMG2(40-202)失去了細(xì)胞保護(hù)活性，CMG2(40-212)、CMG2(40-207)保持了很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)活性。經(jīng)綜合分析，可以初步確定，485的結(jié)合位點(diǎn)在CMG2上40-133氨基酸之間， CMG2的203-207段FQALK氨基酸殘基可能是PA與CMG2相互作用的關(guān)鍵序列。 此外，以單抗485為靶分子對噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行了篩選，希望得到一批

5、特異性結(jié)合485的噬菌體肽，用來分析CMG2活性位點(diǎn)的組成和結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的8個(gè)陽性克隆能夠特異性結(jié)合485，并被CMG2所抑制，表現(xiàn)了它軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文們之間的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。經(jīng)序列對齊比較，8個(gè)陽性克隆與CMG2(40-217)可確定一個(gè)共有序列：YI---LK，位于CMG2上的119-125處，與MIDAS基序中的關(guān)鍵氨基酸T118相臨。此共有序列在TEM8中沒有被發(fā)現(xiàn)，而這種不同也許就是它們在細(xì)胞保護(hù)性方面差異比