短序列增強子和Alu重復序列影響基因表達的實驗研究和生物信息學分析.pdf

1、目的:
　　在本研究中，我們重點研究的是AA序列及其突變序列調節(jié)GFP報告基因表達的作用機制及增強子序列的結構對基因表達所產生的影響。并做了一些關于Alu元件的實驗研究和生物信息學分析。
　　方法:
　　1.DNA模板及引物的合成。
　　2.表達載體的構建。
　　2.1 AA及其衍生序列相關表達載體的構建。
　　2.2 Alu相關表達載體的構建。
　　3.細胞轉染
　　4.熒光顯微鏡觀察<

2、br>　　5.RT-PCR
　　6.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)
　　7.流式細胞儀檢測
　　8.生物信息學分析
　　結果:
　　1.質粒表達載體的構建及鑒定
　　通過酶切和基因測序兩種檢測手段鑒定本文實驗中所用的質粒表達載體均正確。
　　2.AA及其衍生序列對GFP基因表達的影響
　　質粒轉染HeLa胞后，在熒光顯微鏡下觀察計數，通過比較熒光陽性細胞率，我們發(fā)現22R，4TMI，AA可

3、以活化GFP報告基因，而4T，TT，7PieA和7PieT不能活化GFP報告基因，結果具有統(tǒng)計學意義。AA序列中的T堿基逐一突變?yōu)锳，G，C而衍生的15個序列均具有增強子活性，其中大部分突變序列的增強子活性略低于AA序列，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　3.AA序列在轉錄水平增強GFP報告基因表達
　　AA序列活化GFP報告基因能力強于7pieA序列，為了研究AA序列活化GFP報告基因的機制，我們利用RT-PCR方法檢測GFPRN

4、A表達水平。為增加實驗的準確性，我們采用三對引物擴增不同位置的GFP RNA。研究發(fā)現AA序列比7pieA和Alu14序列能夠誘導更多的GFPRNA。這些結果與GFP蛋白檢測結果一致，從而說明質粒中插入AA序列可以增加細胞內GFP RNA含量。由于基因的轉錄增加或者RNA降解減慢都可能造成細胞內RNA含量增加，即GFP RNA含量增加可能發(fā)生在轉錄水平，也可能發(fā)生在RNA降解水平。為了研究這個問題，我們利用放線菌素D抑制RNA生成，再采

5、用RT-PCR檢測GFP RNA含量。在相同實驗條件下，假設細胞中的RNA降解速率相同，實驗發(fā)現質粒中插入AA序列的GFPRNA含量要高于質粒中插入7pieA序列的GFP RNA含量，這些結果表明，AA序列誘導更多GFP報告基因蛋白表達是GFP報告基因轉錄增加的結果，即AA序列增強GFP報告基因表達發(fā)生在轉錄水平。
　　4.利用PAGE觀察DNA寡核苷酸構象
　　在室溫條件的PAGE中，利用20％變性膠PAGE我們發(fā)現AA等

6、7個22 nt寡核苷酸序列的電泳遷移率不同，從快到慢依次為7pieA＞ AA＞22R＞4T＞4TMI＞TT＞7pieT。7pieA, AA,22R,4T,4TMI,TT,7pieT序列中A堿基的數目分別為14，12，8，7，6，2，0。通過相關性分析我們發(fā)現A堿基的數目多少與電泳遷移率快慢成正比關系。由此表明含A堿基較多的序列比含T堿基較多的序列的電泳遷移率要快。
　　然而，在1×TBE和低溫條件的PAGE中，4T序列的電泳遷移率

7、最快，其遷移速度快于15 nt marker的遷移速度;在1×TB-10 mM MgCl2和室溫條件的PAGE中，22R，4T，AA，7pieA和4TMI的電泳遷移率介于22 ntmarkers和19 nt markers之間;在1×TB-10 mM MgCl2和低溫條件的PAGE中，22R，4T，AA，7pieA和4TMI的電泳遷移率介于19 nt markers和15 nt markers之間。
　　5.表達載體中正義Alu和

8、反義Alu組合活化GFP報告基因
　　將表達載體C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2(4TMI-Alu-sense-sense)，C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2as(4TMI-Alu-sense-antis ense)穩(wěn)定轉染HeLa細胞后，經流式細胞儀檢測發(fā)現轉染4TMI-Alu-sense-antisense質粒的GFP標記量是轉染4TMI-Alu-sense-sense質粒GFP標記量的4倍，其

9、中轉染4TMI-Alu-sense-antisense質粒所產生的GFP標記量最高，這表明正義Alu和反義Alu組合可以活化GFP報告基因，促進GFP報告基因表達。
　　6.正義Alu和反義Alu組合活化GFP報告基因具有細胞種屬來源依賴性
　　將表達載體C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2(4TMI-Alu-sense-sense)，C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2as(4TMI-Alu-sen

10、se-antisense)穩(wěn)定轉染HeLa細胞后，經流式檢測可見4TMI-Alu-sense-antisense明顯活化GFP報告基因，而以上質粒轉染BHK21細胞，卻沒有見到明顯的基因活化作用。
　　7.正義Alu和反義Alu活化GFP報告基因具有增強子依賴性
　　無增強子、1個增強子、2個增強子表達載體轉染HeLa細胞誘導的GFP標記量之間的比率為1∶3.3∶12.7，此結果表明表達載體誘導GFP標記量隨著增強子數目增加

11、而上升。
　　8.正義Alu與反義Alu適當搭配活化GFP報告基因需要足夠多的Alu拷貝數
　　當5'端Alu上游與3'端Alu上游均存在增強子時，Alu-sense-antisense表達載體隨著3'端Alu拷貝數的增加，表達載體誘導的GFP標記量上升。由此可以看出正義Alu與反義Alu適當組合活化GFP報告基因需要足夠多的Alu拷貝數。
　　9.正義和反義Alu組合在穩(wěn)定轉染條件下才能夠活化GFP報告基因
　

12、　Alu-sense-sense和Alu-sense-antisense表達載體在瞬時轉染HeLa細胞48小時時GFP標記量達到最高峰，兩組表達載體所誘導的GFP標記量之間沒有明顯的差異。然而Alu-sense-antisense表達載體穩(wěn)定轉染HeL細胞24天后開始表現出明顯的活化GFP報告基因能力，說明正義和反義Alu適當組合活化GFP報告基因必須在穩(wěn)定轉染條件下才能夠實現。
　　10.不同物種α珠蛋白基因簇重復序列分布

13、>　　經生物信息學發(fā)現人類及其他四種動物α珠蛋白基因簇中SINE含量豐富，SINE在α珠蛋白基因簇中分布明顯高于其在β珠蛋白基因簇中分布，α珠蛋白基因簇HBZ基因上下游100kb范圍內的SINE基礎頻率明顯高于其在全基因組分布的平均值。這表明SINE在五個物種的α珠蛋白基因簇中可能發(fā)揮同樣作用，這與α珠蛋白基因表達可能有關。
　　11.基因大片段缺失導致的人類血紅蛋白病
　　經對人類α珠蛋白基因簇基因缺失數據的生物信息學分析

14、發(fā)現，很多類型的基因缺失突變可以導致人類血紅蛋白病，然而在眾多基因缺失病例中，我們發(fā)現唯獨沒有保留HBA1基因同時HBA1下游基因大面積缺失的病例。通過國際千人基因組基因數據庫(http://browser.1000genomes.org/)查詢了正常人HBA1下游基因變異數據，同樣沒有發(fā)現保留HBA1基因但HBA1基因下游基因大面積缺失的數據。
　　12.根據實驗研究和生物信息學分析結果，本文中提出了重復序列活化基因模型:重復序

15、列連同其他非編碼序列使基因處于轉錄和非轉錄的臨界狀態(tài)，重復序列所起的作用主要是抑制基因表達，是沉默子，基因一旦轉錄，轉錄產物中的重復序列RNA形成網格(RNA networks)活化基因，形成轉錄的正反饋，即轉錄產物作為輸入激活輸出。
　　結論:
　　1.AA序列具有增強子活性，能夠活化基因，促進基因轉錄。
　　2.AA序列可能通過非典型互補形成不穩(wěn)定莖環(huán)結構，發(fā)揮增強子活性。
　　3.Alu元件正反組合活化基因

16、必須同時滿足五個條件，否則引起基因沉默。這五個條件是:(1)存在正義和反義Alu組合;(2)細胞種屬來源依賴性:在HeLa中Alu能夠活化基因，在BHK21細胞中Alu不能活化基因;(3)Alu元件上游必須存在增強子;(4)足夠多的Alu拷貝數;(5)穩(wěn)定轉染。提示Alu元件使基因沉默，然而其一旦轉錄正反適當組合則有活化基因作用。
　　4.提出重復序列活化基因模型:基因組中的基因處于轉錄和非轉錄的臨界狀態(tài)，基因一旦轉錄，轉錄產物中