RNA序列、位置及短序列增強(qiáng)子突變影響報(bào)告基因表達(dá).pdf

1、目的:在人和哺乳動(dòng)物基因組中存在大量非編碼DNA序列（non-coding DNA，ncDNA），其功能絕大部分還不清楚。研究非編碼序列對(duì)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制，進(jìn)而探尋非編碼序列新的生物學(xué)功能，對(duì)于認(rèn)識(shí)人和哺乳動(dòng)物的生物學(xué)行為，包括分化和衰老，有重要價(jià)值。
　　由ncDNA轉(zhuǎn)錄得到的非蛋白編碼RNA(non-protein coding RNA，ncRNA)數(shù)量巨大，有研究顯示RNA具有活化基因的作用;本研究室以前的研究也發(fā)現(xiàn)外源R

2、NA可促進(jìn)小鼠白蛋白基因表達(dá)并增加該基因?qū)NaseⅠ消化的敏感性，另外生物信息學(xué)分析同樣也證實(shí)了RNA可以活化基因。雖然已發(fā)現(xiàn)某些ncRNA序列具有活化基因和其它生物學(xué)效應(yīng)，但大多數(shù)ncRNA序列的功能是未知的。在本項(xiàng)研究中，用能夠產(chǎn)生RNA的誘導(dǎo)質(zhì)粒（來自pcDNA3.1載體）和攜帶GFP基因的報(bào)告質(zhì)粒（來自pEGFP-C1載體）轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，研究RNA可能作為一種反式調(diào)節(jié)因子對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響。觀察RNA的長(zhǎng)度、序列和

3、產(chǎn)生位置是否對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)有不同的影響。在三個(gè)層次檢測(cè)RNA產(chǎn)生位置對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響，這三個(gè)層次分別是在GFP基因下游插入序列，插入序列與GFP基因受同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（相當(dāng)于與GFP屬于同一基因）;在質(zhì)粒的插入序列下游再插入CMV啟動(dòng)子，再于CMV啟動(dòng)子的下游插入不同序列（插入序列與GFP基因受不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，相當(dāng)于順式鄰近基因的影響）;第三個(gè)層次觀察共轉(zhuǎn)染的誘導(dǎo)質(zhì)粒上的插入序列產(chǎn)生的RNA對(duì)報(bào)告質(zhì)粒的GFP基因表達(dá)的影

4、響（相當(dāng)于位于不同染色體的基因產(chǎn)生的RNA的影響）。用生物信息學(xué)方法比較正在分化的淋巴細(xì)胞與靜止的淋巴細(xì)胞，觀察這些細(xì)胞中高表達(dá)基因內(nèi)含子大小是否有差異，從而提示內(nèi)含子RNA是否影響基因表達(dá)。
　　增強(qiáng)子是活化基因的順式元件，在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起重要作用。增強(qiáng)子突變會(huì)導(dǎo)致其功能發(fā)生改變。本研究室的前期工作發(fā)現(xiàn):將14個(gè)Alu同向串聯(lián)（Alu×14）后插入到pEGFP-C1質(zhì)粒的GFP基因下游，構(gòu)建C1-Alu×14質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He

5、La細(xì)胞，Alu×14序列顯著抑制GFP基因表達(dá);再將SV40PolyA正、反序列插入到C1-Alu×14質(zhì)粒的GFP和Alu×14之間，結(jié)果顯示SV40PolyA序列能解除Alu×14對(duì)GFP基因的抑制作用。通過刪減SV40PolyA得到一段長(zhǎng)22bp的片段（簡(jiǎn)稱22R，5'-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT，結(jié)構(gòu)見第二部分Fig.1），發(fā)現(xiàn)22R能活化基因，對(duì)22R進(jìn)行點(diǎn)突變后獲得4TMI(5'-GTGAAATAAATG

6、CTTTTTTTGT)，發(fā)現(xiàn)4TMI有更強(qiáng)的活化基因作用。22R和4TMI均有對(duì)稱結(jié)構(gòu)，可能形成不穩(wěn)定莖環(huán)（unstable stem-loopstructure），而22R的另一突變體4T(5'-GTGAAAAAAATGCTTTTTTTGT)不活化基因，其序列可形成穩(wěn)定的莖環(huán)，因此推測(cè)增強(qiáng)子活化基因能力與序列形成不穩(wěn)定莖環(huán)或一定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　為了進(jìn)一步探討22R活化基因的機(jī)理，本研究對(duì)22R序列3核苷酸環(huán)(loop)的堿基進(jìn)

7、行了突變，包括野生型共128個(gè)（其中正序插入64個(gè)，反序64個(gè)），選擇C1-Alu×14作為表達(dá)載體構(gòu)建的基礎(chǔ)，在Alu重復(fù)序列上游插入短序列增強(qiáng)子構(gòu)建表達(dá)載體;然后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、Northern雜交檢測(cè)GFP表達(dá)情況，觀察分析這128種序列對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)分析，探討3堿基loop中堿基類型對(duì)基因表達(dá)影響的規(guī)律，對(duì)闡明DNA結(jié)構(gòu)在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用有重要意義。不穩(wěn)定

8、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因表達(dá)可能是非編碼序列的新功能。
　　方法:1引物及模板DNA片段的合成。委托DNA合成公司合成帶適當(dāng)酶切位點(diǎn)的引物和帶有不同突變位點(diǎn)的DNA模板。論文附表中列出了所使用的引物及模板序列及其名稱。
　　2重組報(bào)告質(zhì)粒和誘導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增目的片段，目的片段包括質(zhì)粒中的DNA序列和合成的DNA片段,酶切后插入pEGFP-C1質(zhì)粒，獲得插有一個(gè)片段報(bào)告質(zhì)粒，利用XbaⅠ/NheⅠ酶切位點(diǎn)可以用T4DNA連接酶

9、連接，但是連接以后的序列不能被其中的任何一個(gè)酶切斷的特性制備同向二串聯(lián)體，或多個(gè)拷貝的插入序列串聯(lián)體的質(zhì)粒。HindⅢ/KpnⅠ酶切pcDNA3.1，瓊脂糖電泳膠分離大片段，帶有串聯(lián)體的報(bào)告質(zhì)粒用HindⅢ/KpnⅠ酶切，膠分離插入串聯(lián)體中的小片段，連接大小片段，獲得正向插入串聯(lián)體的誘導(dǎo)質(zhì)粒;KpnⅠ/XbaⅠ酶切pcDNA3.1，瓊脂糖電泳膠分離大片段，帶有串聯(lián)體的報(bào)告質(zhì)粒用KpnⅠ/XbaⅠ酶切，膠分離插入串聯(lián)體中的小片段，連接大小

10、片段，獲得反向插入串聯(lián)體的誘導(dǎo)質(zhì)粒。
　　3細(xì)胞轉(zhuǎn)染用LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，包括報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和報(bào)告質(zhì)粒與誘導(dǎo)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染兩種轉(zhuǎn)染方法，詳見論文正文。
　　4熒光顯微鏡觀察將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　5 Northern雜交用9N隨機(jī)引物和大腸桿菌DNA聚合酶大片段，將α-32p-dCTP摻入DNA中制備GFP探針。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，甲醛

11、變性瓊脂糖凝膠電泳，將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。32p標(biāo)記的GFP探針雜交、沖洗后通過放射自顯影記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然后，這種雜交過的尼龍膜用剝離液處理，去除32p-GFP探針，用檢測(cè)neo RNA的探針再次雜交，放射自顯影作為轉(zhuǎn)染效率的對(duì)照。
　　6流式細(xì)胞分析委托河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院完成。
　　7 PAGE電泳區(qū)別DNA寡核苷酸構(gòu)象
　　合成的不同DNA單鏈小片段（22nt，帶有單堿基突變）用20％的變性膠在室溫進(jìn)行PAGE，

12、銀染，觀察不同DNA小片段泳動(dòng)速度，然后用非變性膠電泳（改變溫度和離子強(qiáng)度），觀察DNA小片段電泳速度，推測(cè)它們是否形成了不同的空間構(gòu)象。
　　8生物信息學(xué)分析從UniGene庫(kù)獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)。從UniGene庫(kù)獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/lbrowse2.cgi?TAXID=9606&CUTOFF=1000）。選擇高表達(dá)的基因，從人類基因組資源庫(kù)(http://ww

13、w.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)獲得內(nèi)含子和外顯子數(shù)據(jù)，使用微軟Excel軟件對(duì)內(nèi)含子的長(zhǎng)度和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1重組誘導(dǎo)質(zhì)粒及報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定
　　所有構(gòu)建成功用于實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒，均通過酶切和測(cè)序鑒定正確。
　　2 RNA以長(zhǎng)度和序列依賴的方式影響基因表達(dá)
　　誘導(dǎo)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)質(zhì)粒以長(zhǎng)度和序列依賴方式影響基因表達(dá)，例如誘導(dǎo)質(zhì)

14、粒pcAlu×14能引起報(bào)告質(zhì)粒C1-Alu×8中的GFP的表達(dá)，但是誘導(dǎo)質(zhì)粒pc280-1×14不能引起報(bào)告質(zhì)粒C1-Alu×8中的GFP的表達(dá)，說明誘導(dǎo)質(zhì)粒的插入序列不同對(duì)報(bào)告質(zhì)粒的GFP基因影響不同。RNA活化GFP報(bào)告基因也具有長(zhǎng)度依賴性，例如pcAlu×14誘導(dǎo)質(zhì)粒引起的報(bào)告質(zhì)粒的GFP基因的陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于pcAlu×1(p＜0.05)。以上結(jié)果說明:誘導(dǎo)質(zhì)粒產(chǎn)生RNA以序列和長(zhǎng)度依賴的方式影響基因的表達(dá)。
　　3

15、RNA以位置依賴的方式活化基因
　　為了進(jìn)一步研究RNA產(chǎn)生的位置（與GFP同一基因及順式臨近基因）對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響，把目的基因分別插入到GFP基因下游及鄰近部位，研究基因的重復(fù)序列是否可以激活GFP基因的表達(dá)。
　　質(zhì)粒C1-Alu×1-Alu×14比質(zhì)粒C1-280-1×1-280-1×14有更強(qiáng)的基因抑制作用;在具有增強(qiáng)子4TMI時(shí)，Alu序列（C1-Alu×1-4TMI×2-Alu×14）誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)

16、比280-1（C1-280-1×1-4TMI×2-280-1×14）更強(qiáng);分析下游序列對(duì)GFP基因表達(dá)的的影響與產(chǎn)生的RNAs（從基因本身產(chǎn)生的RNA影響其自身表達(dá)）有關(guān)。
　　在C1-280-1×14載體中280-1×14的下游插入CMV，然后在CMV啟動(dòng)子的下游插入不同的序列，構(gòu)建質(zhì)粒（相當(dāng)于改變GFP基因相鄰基因的序列）。結(jié)果表明，質(zhì)粒C1-280-1×14-CMV-280-1×2中CMV下游插入的2個(gè)280-1正和Alu-

17、280-1正比其他序列有活化GFP報(bào)告基因作用。插入含有兩個(gè)相同序列的誘導(dǎo)質(zhì)粒對(duì)C1-280-1×14中的GFP基因表達(dá)沒有顯著影響（數(shù)據(jù)見論文第一部分）。
　　同一基因和臨近基因序列對(duì)GFP報(bào)告基因產(chǎn)生明顯影響，但是誘導(dǎo)質(zhì)粒中的同樣序列產(chǎn)生影響較弱。這些結(jié)果說明，RNA產(chǎn)生的位置是影響報(bào)告基因表達(dá)的因素。
　　當(dāng)這些重復(fù)序列分別插入pcDNA3.1載體中構(gòu)造誘導(dǎo)質(zhì)粒與相應(yīng)報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時(shí)，他們沒有激活報(bào)告基因，這些結(jié)果

18、表明,RNA序列和RNA產(chǎn)生位置是影響基因表達(dá)的重要因素。
　　4在分化細(xì)胞中大基因高表達(dá)通過生物信息學(xué)分析比較胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞，生發(fā)中心B細(xì)胞和B細(xì)胞中高表達(dá)基因中大基因(≥60000bp)的數(shù)量，比較高表達(dá)基因中內(nèi)含子的大小，發(fā)現(xiàn)在未分化細(xì)胞中大基因數(shù)量多，平均每個(gè)內(nèi)含子的堿基多。
　　522R序列l(wèi)oop3堿基突變體（正序）對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響
　　22R序列（5'-GTGAAAAAAATGCTTTATTT

19、GT）及其loop3堿基的突變體（正序）分別插入到C1-Alu×14載體的Alu序列上游，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果和熒光顯微鏡分析及Northern Blot均表明，loop環(huán)3堿基突變可明顯影響增強(qiáng)子的活性。例如:GTG質(zhì)粒（5'-GTGAAAAAAAGTGTTTATTTGT）熒光陽(yáng)性率為3.77％，AAA質(zhì)粒（5'-GTGAAAAAAAAAATTTATTTGT）熒光陽(yáng)性率為0.24％。
　　622R序

20、列l(wèi)oop3堿基突變體反序列對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響
　　將兩拷貝的22R序列l(wèi)oop3堿基突變體反序構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞，22R突變體反序大部分的熒光陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)和平均熒光強(qiáng)度高于其正序，如:CTG正序百分?jǐn)?shù)為43.23，平均熒光強(qiáng)度為6.5，反序百分?jǐn)?shù)為65.06，平均熒光強(qiáng)度為25.2熒光強(qiáng)度平均數(shù)的比值（反序/正序）為3.88; AGG正序百分?jǐn)?shù)為52.85，平均熒光強(qiáng)度為11.9

21、，反序百分?jǐn)?shù)為60.75，平均熒光強(qiáng)度為25.4，熒光強(qiáng)度平均數(shù)的比值（反序/正序）為2.84;僅有一個(gè)例外，AGC正序百分?jǐn)?shù)為67.17，平均熒光強(qiáng)度為18.8，反序百分?jǐn)?shù)為60.75，平均熒光強(qiáng)度為25.4，熒光強(qiáng)度平均數(shù)的比值（反序/正序）為1.35，說明突變體的反序活化基因作用強(qiáng)于其正序。
　　7 PAGE電泳區(qū)別DNA寡核苷酸構(gòu)象用20％的變性膠在室溫進(jìn)行PAGE，發(fā)現(xiàn)所有的寡核苷酸的電泳遷移率基本相同。而在低溫和增大離

22、子強(qiáng)度時(shí)富含T堿基的序列遷移率受影響較小，所以用富含T的序列作為分子量對(duì)照，在室溫，1×TBE緩沖液中電泳，TAA、TAT、TAC、TAG和CTA序列的泳動(dòng)速度最快，而其他序列的遷移率相當(dāng)。在更低溫度(4℃)下1×TBE緩沖液中進(jìn)行電泳，雖然不同序列的遷移率有更大的差別，但是TAA、TAT、TAC、TAG和CTA序列的泳動(dòng)速度還是最快的。這些結(jié)果說明loop位堿基影響序列的次級(jí)結(jié)構(gòu),可能涉及到增強(qiáng)子活性。
　　結(jié)論:
　　1

23、 RNA以長(zhǎng)度和序列依賴的方式特異性影響基因表達(dá)，誘導(dǎo)質(zhì)粒的插入序列和長(zhǎng)度不同對(duì)報(bào)告質(zhì)粒的GFP基因影響不同。
　　2 RNA產(chǎn)生位置顯著影響基因表達(dá)，同一基因和臨近基因序列對(duì)GFP報(bào)告基因產(chǎn)生明顯影響，但是誘導(dǎo)質(zhì)粒中的同樣序列產(chǎn)生影響較弱。
　　322R Loop的堿基類型影響序列的次級(jí)結(jié)構(gòu)，顯著影響增強(qiáng)子活性。
　　422R突變體正反序?qū)FP基因表達(dá)的影響不同，反序大部分的熒光陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)和平均熒光強(qiáng)度高于其正序。