異常腺苷A2A受體信號(hào)在突觸核蛋白病小鼠模型中的作用.pdf

1、第一部分腦內(nèi)注射不同α-synuclein原纖維誘導(dǎo)的病理改變和腺苷A2A受體上調(diào)
　　目的:用野生型(wild-type，WT)及A53T突變型α-synuclein（α-Syn）分別進(jìn)行腦內(nèi)注射制作突觸核蛋白病小鼠模型，觀察兩種α-Syn誘導(dǎo)的病理改變和腺苷A2A受體(adenosine A2A receptor，A2AR)的表達(dá)，為突觸核蛋白病的早期診斷尋找新的生物標(biāo)記物。
　　方法:利用基因工程技術(shù)體外人工合成WT及

2、A53Tα-Syn原纖維，健康成年雄性C57BL/6小鼠96只，體質(zhì)量22-26 g，隨機(jī)分為A、B、C、D四組，每組24只，分別進(jìn)行紋狀體、海馬、皮層及黑質(zhì)四個(gè)腦區(qū)的單側(cè)立體定位注射造模，A、B、C、D每組再隨機(jī)分為1、2、3三組，每組8只，分別注射A53Tα-Syn原纖維、WTα-Syn原纖維及無(wú)菌PBS。一個(gè)月后取造模鼠腦組織進(jìn)行檢測(cè)，采用免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色觀察注射腦區(qū)及相關(guān)腦區(qū)的磷酸化α-Syn(pSyn)免疫活性變化，

3、評(píng)價(jià)α-Syn病理包涵體的形成情況;采用免疫熒光染色觀察注射腦區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）及核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)膠質(zhì)反應(yīng)及炎癥反應(yīng)情況;采用TUNEL染色檢測(cè)注射腦區(qū)細(xì)胞凋亡情況;紋狀體造模鼠采用免疫熒光染色觀察紋狀體區(qū)γ H2A.X的表達(dá)，評(píng)價(jià)DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)情況;

4、黑質(zhì)造模鼠采用免疫熒光染色觀察黑質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase,TH)的免疫活性變化，評(píng)價(jià)多巴胺能神經(jīng)元受損情況;采用免疫熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)、實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitativePCR，RT-qPCR)檢測(cè)注射腦區(qū)A2AR有無(wú)表達(dá)上調(diào);海馬造模鼠采用免疫熒光雙標(biāo)染色分析α-Syn包涵體和A2AR誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞類型以及兩者之間的關(guān)系。
　　

5、結(jié)果:
　　1.各腦區(qū)造模鼠A53Tα-Syn組及WTα-Syn組在注射腦區(qū)均有pSyn陽(yáng)性包涵體形成，且A53Tα-Syn組pSyn陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著高于WTα-Syn組(p＜0.05)。pSyn陽(yáng)性包涵體大部分與神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)共定位，少部分與GFAP和Iba-1共定位。
　　2.海馬、皮層、黑質(zhì)造模鼠A53Tα-Syn組注射腦區(qū)GFAP和NF-κB表達(dá)水平均顯著

6、高于WTα-Syn和PBS組(p＜0.05)。
　　3.海馬、皮層、黑質(zhì)造模鼠A53Tα-Syn組及WTα-Syn組均有TUNEL陽(yáng)性染色，且A53Tα-Syn組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于WTα-Syn組(p＜0.05)。
　　4.紋狀體造模鼠A53Tα-Syn組紋狀體區(qū)γH2A.X陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于WTα-Syn組，黑質(zhì)造模鼠A53Tα-Syn組黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于PBS組(p＜0.05)。
　　5.海馬、

7、皮層、黑質(zhì)造模鼠A53Tα-Syn組注射腦區(qū)A2AR表達(dá)水平均顯著高于WTα-Syn和PBS組(p＜0.05)，WTα-Syn和PBS組則無(wú)顯著性差異。A2AR染色與NeuN、GFAP、Iba-1染色均存在共定位，與pSyn染色也有較好的共標(biāo)。
　　結(jié)論:A53Tα-Syn腦內(nèi)注射較WTα-Syn誘導(dǎo)更明顯的神經(jīng)退行性變，這一過(guò)程伴隨A2AR表達(dá)的顯著上調(diào)，提示異常上調(diào)的A2AR可作為一個(gè)新的突觸核蛋白病的生物標(biāo)記物。
　　

8、第二部分腺苷2A受體敲除對(duì)突觸核蛋白病小鼠模型的作用
　　目的:用WT及A2AR敲除(knockout，KO)小鼠分別進(jìn)行A53Tα-Syn腦內(nèi)注射制作突觸核蛋白病動(dòng)物模型，觀察兩種小鼠發(fā)生的行為學(xué)及病理改變，探尋A2AR在突觸核蛋白病中的確切作用，推進(jìn)突觸核蛋白病發(fā)病機(jī)制的研究，并為A2AR信號(hào)通路作為疾病有效的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:健康成年雄性A2AR KO小鼠及其同窩出生仔WT小鼠各32只，體質(zhì)量22-26

9、 g，兩種基因型小鼠各隨機(jī)分為A、B兩組，每組16只，A組進(jìn)行雙側(cè)紋狀體注射造模，B組進(jìn)行雙側(cè)海馬注射造模，A組再隨機(jī)分為1、2兩組，每組8只，1組注射A53Tα-Syn原纖維，2組注射無(wú)菌PBS，同樣B組也隨機(jī)分為1、2兩組，每組8只，1組注射A53Tα-Syn原纖維，2組注射無(wú)菌PBS。兩個(gè)月后所有小鼠先進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)(open-field test，OFT)和自發(fā)交替行為(spontaneous alternation behavi

10、or，SAB)試驗(yàn)，然后取腦組織進(jìn)行檢測(cè)。采用免疫組織化學(xué)方法觀察注射腦區(qū)及相關(guān)腦區(qū)的pSyn免疫活性變化，評(píng)價(jià)α-Syn病理包涵體的形成情況;紋狀體造模鼠采用免疫熒光染色觀察紋狀體區(qū)γH2A.X的表達(dá)，評(píng)價(jià)DNA DSBs情況;海馬造模鼠采用免疫熒光染色觀察海馬區(qū)GFAP和NF-κB表達(dá)情況，用WB檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)改變，評(píng)價(jià)膠質(zhì)反應(yīng)及炎癥反應(yīng)情況，另外采用

11、TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;海馬造模的WT鼠采用免疫熒光染色檢測(cè)海馬區(qū)A2AR有無(wú)表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)果:
　　1.兩個(gè)腦區(qū)（紋狀體和海馬）造模的兩種基因型小鼠A53Tα-Syn組相較PBS組OFT總運(yùn)動(dòng)距離均無(wú)顯著性差異;兩個(gè)腦區(qū)造模的WT鼠A53Tα-Syn組相較PBS組SAB正確率均有顯著降低(p＜0.05)，而A2AR KO鼠兩組SAB正確率無(wú)顯著性差異。
　　2.兩個(gè)腦區(qū)（紋狀體和海馬）造模的WT鼠A53T

12、α-Syn組相較PBS組注射腦區(qū)及相關(guān)腦區(qū)的pSyn陽(yáng)性細(xì)胞百分比均顯著升高(p＜0.05)，而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相較WT鼠pSyn陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低(p＜0.05)。
　　3.紋狀體造模的WT鼠A53Tα-Syn組相較PBS組紋狀體區(qū)的γH2A.X陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高(p＜0.05)，而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相較WT鼠γH2A.X陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低(p＜0.05)。
　　4.海馬造

13、模的WT鼠A53Tα-Syn組相較PBS組海馬區(qū)的GFAP、NF-κB和iNOS表達(dá)水平顯著升高(p＜0.05)，而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相較WT鼠GFAP、NF-κB和 iNOS表達(dá)水平顯著降低(p＜0.05)。
　　5.海馬造模的WT鼠A53Tα-Syn組相較PBS組海馬區(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高(p＜0.05)，而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相較WT鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低(p＜0.

14、05)。
　　6.海馬造模的WT鼠A53Tα-Syn組相較PBS組海馬區(qū)的A2AR表達(dá)水平顯著升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:A2AR KO可以逆轉(zhuǎn)A53Tα-Syn腦內(nèi)注射誘導(dǎo)的認(rèn)知損害及一系列神經(jīng)退行性變，提示A53Tα-Syn誘導(dǎo)的異常A2AR信號(hào)增高通過(guò)調(diào)控α-Syn的聚集或直接作用對(duì)神經(jīng)退行性變和認(rèn)知功能損害發(fā)揮雙重控制作用，這可能是突觸核蛋白病的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，也為A2AR拮抗劑作為突觸核蛋白病的有效治療藥物