利福平抑制α-突觸共核蛋白聚集作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一.研究背景 帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一種常見于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)—紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、死亡，同時(shí)伴隨殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體(路易小體，Lewy小體)，紋狀體多巴胺含量降低。α-突觸共核蛋白(α-synuclein)聚集形成的不溶性纖維積聚物，是構(gòu)成路易小體(帕金森病主要病理特征)主要成份；并且隨著對帕金森病的深入研究，在其病因及發(fā)病機(jī)制方面已取得

2、了很大的進(jìn)展。越來越多的證據(jù)顯示，可溶性α-synuclein向異常纖維狀的α-synuclein轉(zhuǎn)化是帕金森病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是帕金森病各種誘發(fā)因素的共同通路。 研究表明，在基因突變及環(huán)境因素協(xié)同作用下，多巴胺能細(xì)胞內(nèi)α-synuclein發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多巴胺濃度提高，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。α-synuclein的聚集亦能影響泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對其降解，進(jìn)一步造成大量的α-synuclein的聚集并形成細(xì)胞

3、內(nèi)包涵體，影響細(xì)胞正常功能及代謝，從而引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致帕金森病。 目前帕金森病新的治療方法有外科手術(shù)、腦深部電極高頻刺激、基因治療、神經(jīng)干細(xì)胞移植等，但療效均未有很大突破，大多數(shù)病人仍需藥物治療。外源性左旋多巴是最有效的抗帕金森病藥物，但只能控制癥狀而無法阻止疾病的進(jìn)展，并且長期使用左旋多巴會引起一些癥狀波動(dòng)、運(yùn)動(dòng)障礙和精神異常等并發(fā)癥，其中尤其是開—關(guān)現(xiàn)象、異動(dòng)癥等并發(fā)癥使患者及其家屬產(chǎn)生畏懼感。因此，尋找一種能夠阻止疾病進(jìn)

4、展的藥物，將為帕金森病的治療帶來新的希望。 利福平(rifampicin，RFP)是半合成利福霉素的衍生物，為廣譜抗生素，是諾卡氏菌的發(fā)酵產(chǎn)物，在臨床應(yīng)用已久，為抗結(jié)核的主要藥物之一。另可用于麻風(fēng)病治療，并且隨著藥理學(xué)和藥效學(xué)研究的深入開展，利福平的應(yīng)用己越來越廣泛。 流行病學(xué)研究顯示，服用抗麻風(fēng)病藥物利福平或氨苯砜幾年的麻風(fēng)病人，其老年性癡呆的患病率明顯減低，推測抗麻風(fēng)藥物可能有抑制β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，

5、Aβ)聚集的作用。并有大量研究表明利福平有抑制β淀粉樣蛋白聚集的作用，但具體的機(jī)制仍不清楚，推測利福平可能作為一種自由基清除劑起作用。由α-synuclein及其碎片聚集形成的病理性包涵體除存在于帕金森病外，還存在于老年性癡呆患者的老年斑中，而且α-synuclein與β-淀粉樣蛋白共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及它們之間的相互作用，提示了帕金森病和老年性癡呆病理過程的相似性。另據(jù)美國加州大學(xué)生化部的生化物理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，抗生素利福平以濃度依賴的

6、形式抑制α-synuclein纖維形成，使其現(xiàn)有的纖維解聚。該研究的結(jié)果是令人興奮的，因?yàn)樽柚沽甩?synuclein的聚集，就有可能阻止帕金森病的進(jìn)展，而使已經(jīng)聚集的α-synuclein纖維解聚，甚至有可能使疾病逆轉(zhuǎn)。但目前國內(nèi)外尚未見到利用細(xì)胞和動(dòng)物模型來驗(yàn)證這一結(jié)論。我們利用1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞大量表達(dá)α-synuclein，并產(chǎn)生聚集，觀察利福平抑制α-synuclein聚集的作用，為進(jìn)一步

7、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及其應(yīng)用于帕金森病的臨床治療提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二.研究目的 1.構(gòu)建大量表達(dá)α-synuclein并產(chǎn)生聚集的帕金森病細(xì)胞模型。 2.明確利福平對帕金森病細(xì)胞模型有保護(hù)作用。 3.探討利福平具有抑制α-synuclein聚集的作用。 4.為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用于帕金森病的臨床治療提供依據(jù)。 三.實(shí)驗(yàn)對象和方法 1.細(xì)胞株 PC12：大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株。

8、 2.細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 PC12細(xì)胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔48h換培養(yǎng)液，當(dāng)單層培養(yǎng)細(xì)胞匯合以后，傳代培養(yǎng)。將PC12細(xì)胞傳入96或6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后加藥，加入不同劑量的利福平，利福平溶解于甲醇中，使終濃度分別達(dá)到0、100、200、300μmol/L，2h后分別加入MPP+，終濃度為1mmol/L，以上劑量用于所有實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組：(1)正常對照組；(2)0μmol

9、/L利福平&MPP+(MPP+組)；(3)100μmol/L利福平&MPP+；(4)200μmol/L利福平&MPP+；(5)300μmol/L利福平&MPP+；(6)等體積甲醇&MPP+組六組。 3.研究方法 (1)四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測 干預(yù)48h后每孔加入20μlMTT，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，棄液，每孔加入150μlDMSO，振蕩儀振蕩10min，至晶體顆粒溶解，在酶標(biāo)儀上測定595n

10、m的吸光度。 (2)WesternBlot免疫印記檢測α-synuclein的表達(dá) 干預(yù)48h后，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；BCA-100蛋白質(zhì)定量測定試劑盒測定樣品總蛋白含量；每泳道加總蛋白20μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉3h，一抗孵育4℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫下孵育1h，X線膠片曝光1～10min，顯影、定影，圖像分析處理。 (3)流式細(xì)胞儀檢

11、測細(xì)胞凋亡 PC12細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48h后干預(yù)處理，繼續(xù)培養(yǎng)48h后PBS漂洗，加入AnnexinV-FITC和PI染液重懸細(xì)胞，室溫避光溫育10分鐘，HEPES洗滌后過濾上機(jī)檢測，分析結(jié)果。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

12、 1.MTT檢測細(xì)胞活性顯示 MTT比色法檢測各組細(xì)胞活性結(jié)果顯示，MPP+處理組細(xì)胞存活率為76.6％±6.4％，甲醇&MPP+組細(xì)胞存活率為71.2％±9.9％，較對照組細(xì)胞活性明顯下降，而利福平(100、200、300μmol/L)&MPP+處理組細(xì)胞存活率分別為91.9％±7.9％、99.8％±8.0％、100.1％±9.1％，利福平&MPP+各組較MPP+處理組細(xì)胞活性明顯增加，并呈量效依賴關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MPP+處理

13、組與空白對照組比較，P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；利福平&MPP+各組與MPP+處理組比較，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，甲醇&MPP+組與MPP+組無差異。 2.Westernblot免疫印記檢測α-synuclein顯示 免疫印記結(jié)果顯示，MPP+促進(jìn)α-synuclein的表達(dá)并聚集形成三聚體，隨著利福平的藥物濃度增大，α-synuclein三聚體蛋白的表達(dá)減少，而甲醇&MPP+組與MPP+組無差異。 3.流式細(xì)

14、胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示 流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果，空白對照組、MPP+處理組、甲醇&MPP+組及利福平(100、200、300μmol/L)&MPP+各濃度組的細(xì)胞凋亡率分別為10.63％±0.98％、67.35％±1.72％、74.74％±1.85％、63.45％±1.24％、27.01％±2.74、％22.35％±2.9％；結(jié)果顯示MPP+組及甲醇&MPP+組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組，而利福平&MPP+各組隨著利福平的濃度增