腺苷A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用及機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumaticbraininjury,TBI)死亡率、致殘率高，在現(xiàn)代社會中嚴重威脅人類生命及生活質量。 創(chuàng)傷性顱腦損傷分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩方面。原發(fā)性損傷包括顱骨骨折、顱內出血等，對于這些損傷目前已可經(jīng)過外科手術得到較好的解決。繼發(fā)性損傷則包括興奮性毒性損傷、過度炎性反應和氧自由基損傷等，這些損傷因素嚴重影響著病人的預后，針對這些繼發(fā)性損害的治療措施，一直是研究的熱點問題。 腺苷廣泛存在于各

2、種組織的細胞外液。在包括創(chuàng)傷性顱腦損傷在內的多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，由于ATP的大量崩解，腦內腺苷濃度會大幅度升高。A2A受體為四種腺苷受體之一，在多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，激活A2A受體既可產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，又可加重組織損傷，對這些矛盾效應的機制目前尚不明確，而在急性創(chuàng)傷性顱腦損傷中A2A受體發(fā)揮何種效應也尚無定論。本研究的目的既是對在急性創(chuàng)傷性顱腦損傷中A2A受體發(fā)揮何種作用進行觀察，并對其復雜效應的可能機制進行探討，以期為臨床治療中合理

3、使用A2A受體調節(jié)藥物提供理論依據(jù)。 一、通過藥理學干預觀察A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用 咖啡因為一種非選擇性的腺苷受體拮抗劑，但在低劑量時，主要對A2A受體起作用。CGS21680則是一種高選擇性的A2A受體激動劑。本實驗采用上述兩種藥物對小鼠進行干預，對A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用進行研究。 方法 成年昆明白小鼠，隨機分為四個處理組：1、無藥物干預組；2、慢性咖啡因干預組：小鼠自出生后35-4

4、0d在飲水中加入0.25g/L咖啡因，連續(xù)飲用3w后用于實驗；3、急性咖啡因干預組：致傷前30min腹腔給予咖啡因15mg/kg；4、急性CGS21680干預組：致傷前30min腹腔給予CGS216800.1mg/kg。每個處理組又包括對照組及急性腦撞擊傷組。腦撞擊傷模型采用自由落體法建立，使用20g重物自50cm高度墜落撞擊致傷。在傷后12h用高校液相法測定腦脊液中谷氨酸含量、定量PCR法測定損傷周圍腦組織炎性因子腫瘤壞死因子-α(t

5、umornecrosisfactor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的mRNA表達變化。在傷后24小時進行小鼠的神經(jīng)功能缺損評分，此后HE染色觀察腦組織病理變化，并用干濕重法測定損傷側大腦皮層腦組織含水量。 主要結果 1.急性給予A2A受體拮抗劑咖啡因和激動劑CGS21680對腦撞擊傷后24小時神經(jīng)功能缺損程度和傷側大腦皮層含水量無明顯影響(P＞0.05)。但慢性給予咖啡因干預

6、，可明顯降低腦撞擊傷后24小時腦組織含水量(P＜0.01)，改善神經(jīng)功能缺損程度(P＜0.01)。 2.急性給予咖啡因和CGS21680干預對傷后12小時小鼠腦脊液中谷氨酸含量水平無明顯影響(P＞0.05)；而慢性給予咖啡因干預則可顯著降低傷后12小時腦脊液中谷氨酸水平(P＜0.01)。 3.與無藥物干預組比較，急性給予咖啡因和CGS21680干預的小鼠在腦撞擊傷后12小時傷側腦組織炎性因子TNF-α，IL-1β的mRN

7、A表達較對照組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而給予咖啡因慢性干預的小鼠炎性因子表達則較無藥物處理組明顯升高(P＜0.05)。 討論 腺苷A2A受體主要偶聯(lián)于Gs蛋白，活化后引起胞內環(huán)磷酸腺苷濃度升高，促進鈣離子內流。在神經(jīng)系統(tǒng)，可以促進突觸前膜釋放谷氨酸，但在炎性反應調控中存在抑炎和促炎兩種調控方向。本實驗結果顯示：在急性腦撞擊傷中，持續(xù)給予A2A受體拮抗劑——咖啡因具有抑制興奮性遞質谷氨酸釋放和促炎的雙重效應，但可

8、顯著降低腦撞擊傷急性期的神經(jīng)損傷，其原因可能是由于拮抗興奮性遞質釋放的保護效應超過了促炎的損傷作用。 二、利用A2A受體基因敲除小鼠觀察A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用 為避免由于咖啡因和CGS21680的藥理局限性給實驗結果帶來的可能影響，在本部分實驗中采用A2A受體基因敲除小鼠進一步觀察A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用。方法 實驗動物使用成年A2A受體基因敲除純合子小鼠及其同胞的野生型小鼠。A2A受體基因敲除

9、小鼠及野生型小鼠隨機分為假手術對照組，腦撞擊傷組。在傷后6h、12h和24h3個時相點抽取小鼠腦脊液，高效液相色譜法測定腦脊液中谷氨酸濃度，并提取傷側腦組織RNA，定量PCR法檢測炎性因子TNF-α，IL-1β的mRNA表達變化；此外，在傷后24小時還對小鼠傷后神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量和病理變化情況進行觀察。 主要結果 1.基因敲除A2A受體可明顯降低腦撞擊傷后24h腦組織含水量(P＜0.01)，改善神經(jīng)功能缺損程

10、度(P＜0.01)。 2.基因敲除A2A受體小鼠(KO)在傷后6h腦脊液谷氨酸水平達高峰，此后明顯下降。野生型小鼠(WT)傷后6h腦脊液谷氨酸水平同樣明顯高于對照組，但是在12h進一步升高，24h才開始回落。 3.腦撞擊傷后12h，KO小鼠傷側腦組織炎性因子TNF-α，IL-1β的mRNA表達明顯高于野生型小鼠。傷后24h兩組小鼠傷側腦組織炎性因子表達無顯著差異。 討論 利用A2A受體基因敲除小鼠觀察A2

11、A受體在腦撞擊傷中的效應，可以有效避免因拮抗劑選擇性不夠產(chǎn)生的影響作用。本實驗結果顯示，基因敲除A2A受體可以抑制傷后谷氨酸的釋放；對炎性反應的調節(jié)效應則在病程不同階段發(fā)生變化：在早期(12h)對炎性因子表達有促進作用，但24h時促炎效應減退。由于敲除A2A受體在腦撞擊傷急性期的最終效應是降低腦水腫，減輕神經(jīng)損傷，因此，在腦撞擊傷急性期，抑制A2A受體活性可能以減少谷氨酸釋放的作用為主，并因此產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。 三、谷氨酸對小膠

12、質細胞A2A受體調控一氧化氮合酶活力作用的影響 A2A受體在神經(jīng)體統(tǒng)中對炎性反應具有雙重的調控效應。但這一雙重效應的機制尚不清楚。谷氨酸釋放增加是神經(jīng)系統(tǒng)損傷中普遍存在的病理過程。其濃度變化有可能影響A2A受體在炎性反應中的調控方向。 方法 使用出生后1-3天的C57BL/6野生型小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)小膠質細胞。細胞分為如下幾組： 1.空白對照組：單純加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基；

13、 2.LPS組：加入LPS1000ng/ml進行刺激； 3.LPS+CGS21680組：在加入LPS的同時加入100nM的CGS21680進行干預 4.LPS+CGS21680+谷氨酸組：同時分別給予0.1mM、0.25mM、0.5mM谷氨酸及與前述相同劑量的LPS和CGS21680； 5.LPS+谷氨酸組：在給1000ng/ml的LPS同時分別給予0.1mM、0.25mM、0.5mM谷氨酸。 主要結

14、果 1.LPS刺激可誘發(fā)小膠質細胞中總NOS活力及iNOS活力明顯增高，給予A2A受體選擇性激動劑CGS21680激活A2A受體會對該反應產(chǎn)生抑制作用。 2.同時加入不同濃度谷氨酸時，CGS21680的作用根據(jù)谷氨酸濃度的不同而發(fā)生變化，在較低濃度谷氨酸存在時，CGS21680仍保持了抑制NOS生成的作用，但是在較高濃度的谷氨酸和A2A受體激動劑同時存在時，A2A受體激動劑抑制NOS活性的作用被逆轉，使NOS活力反而較L

15、PS組更為增高。 3.僅加入高濃度谷氨酸，NOS活力低于同時加入CGS21680組。 討論 本部分實驗結果提示，在神經(jīng)系統(tǒng)中，A2A受體對炎性反應的調控方向可能會受到谷氨酸濃度的影響，高濃度谷氨酸可以使該受體的抑炎效應向促炎方向轉化，這有可能是A2A受體在神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應調控中矛盾作用的原因之一。 結論 一、慢性低劑量咖啡因干預可以有效減輕中度腦撞擊傷急性期神經(jīng)損傷。其主要原因為慢性飲用咖啡因，有

16、效抑制了腦撞擊傷后谷氨酸的釋放，減少了谷氨酸的興奮性毒性損傷。 二、基因敲除小鼠可有效降低中度腦撞擊傷急性期神經(jīng)功能缺損，降低腦水腫，具有神經(jīng)保護效應。敲除A2A受體明顯抑制腦撞擊傷后谷氨酸的釋放。A2A受體活化在中度腦撞擊傷早期具有抑炎作用，其后抑炎效應減退。 三、激活A2A受體可以抑制活化的小膠質細胞中NOS活力的增高，但當有高濃度谷氨酸存在時，這一抑制作用被逆轉，反而產(chǎn)生促進NOS活力增高的作用。因此，谷氨酸濃度水