男性脫發(fā)癥病變毛囊與正常毛囊的差異性研究.pdf

1、男性脫發(fā)癥(AGA)是世界上最常見的皮膚疾病之一，困擾著我國超過1億的成年男性。且其發(fā)病率隨著我國社會生活的快節(jié)奏化和人口老齡化，而呈現逐漸升高的趨勢。已知AGA的主要誘因是雄激素雙氫睪酮(DHT)體內濃度改變。另外遺傳背景、營養(yǎng)狀況、精神壓力、衰老程度、免疫反應、外來損傷等因素也在AGA發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但這種疾病的具體發(fā)病機制至今仍不完全清楚。目前臨床上可用于治療AGA的藥物僅有抑制DHT生成的Finasteride和血管

2、擴張劑Minoxidil兩種。前者有影響男性性功能的潛在副作用，后者在停藥后會導致更為嚴重的脫發(fā)，在臨床上均難以實現理想的療效。而開發(fā)更為有效的AGA治療方法將需要我們深入解析AGA的發(fā)病機制，并開發(fā)其針對性的干預手段。
　　男性脫發(fā)具有較為固定的發(fā)展模式。一般前額與頭頂部最先禿發(fā)，而枕后部區(qū)域的毛發(fā)則保持生長。將枕后部毛囊移植到前額禿發(fā)區(qū)仍可正常生長毛發(fā)，提示毛發(fā)生長停滯的根本原因在于毛囊自身而非其周邊環(huán)境(20世紀50年代提出

3、的“優(yōu)勢供區(qū)”理論)。毛發(fā)生長由毛囊內部的毛囊干細胞驅動，并隨著這些干細胞在激活與靜止狀態(tài)之間的來回切換而呈現出生長-退行-休止的周期性循環(huán)。在AGA的發(fā)病過程中毛囊逐步萎縮，生長期縮短，休止期延長，最終失去再生毛發(fā)的能力。但我們對毛囊干細胞在這個疾病過程中的病理轉變過程及其機制仍然缺乏了解。有研究顯示脫發(fā)區(qū)域中的毛囊干細胞并未消失，只是處于異常的休止狀態(tài)而無法產生毛發(fā)。而闡明這種異常休止狀態(tài)的分子機制將為其針對性治療方案的開發(fā)提供線索

4、。
　　既往文獻中對AGA的病理學分析多基于禿發(fā)頭皮與健康頭皮的直接對比。但完全禿發(fā)區(qū)域的毛囊往往存在結構異常、脂溢、感染、發(fā)炎等現象。不易區(qū)分導致脫發(fā)的直接病理因素與次生現象，也未能闡明毛囊干細胞在AGA發(fā)展過程中的病理轉變過程。在本課題中，為了深入闡明毛囊干細胞在AGA發(fā)病中的病理轉變過程及其分子機制，本人將從脫發(fā)癥患者前額脫發(fā)區(qū)邊緣剛開始毳毛化但尚未完全禿發(fā)的臨界區(qū)域中收集毛囊樣品，并與來自同一患者的枕后部未脫發(fā)區(qū)頭皮及健康

5、人頭皮的毛囊樣品進行對比分析，解析它們在形態(tài)結構以及其中毛囊干細胞數量、位置、增殖、分化上的差異。隨后，本人還將開發(fā)一套從人類毛囊樣品中分離純化毛囊干細胞的有效技術手段，并在國際上首次嘗試對脫發(fā)臨界區(qū)及對照區(qū)域的毛囊干細胞進行轉錄組比較分析。通過這些研究，我將進一步揭示AGA發(fā)病的毛囊干細胞機制，為開發(fā)AGA的新型靶向治療方案奠定基礎。
　　目的：
　　(1)對比AGA脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)以及正常人群枕后區(qū)的毛囊形態(tài)結構及其中

6、的毛囊干細胞數量、位置、增殖、分化之間的差異。
　　(2)建立從頭皮樣品中分離純化人類毛囊干細胞的技術體系。
　　(3)建立對微量毛囊細胞進行轉錄組分析的技術體系，并轉錄組分析探索AGA脫發(fā)臨界毛囊干細胞與正常毛囊干細胞的基因表達差異。
　　方法：
　　(1)對AGA人群脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)與正常人群（男、女）枕后區(qū)的毛囊進行解剖觀察不同毛囊組間的形態(tài)學差異，測量毛囊單位的生長期毛囊數量以及生長期毛囊的長度;通過對

7、不同組間毛囊進行免疫組化分析，分別從毛囊的結構、干細胞、增殖等方面進行對比分析，獲得病變與正常毛囊的基本數據，旨在能系統(tǒng)性分析病變與正常毛囊間的大體存在的差異性。
　　(2)擬以顯微操作與酶消化法相聯合，通過DispaseⅡ分散酶從皮膚中分離毛囊，構建一個毛囊模型。對所構建的毛囊模型分別進行HE染色、免疫組化實驗，觀察毛囊結構，驗證毛囊模型的純度及完整性。通過構建毛囊模型，進一步比較AGA臨界毛囊、AGA枕后毛囊與正常人毛囊的干細

8、胞含量的差異。同時通過磁珠免疫法進一步純化毛囊細胞，為純化分離毛囊干細胞提供一種新的方法，并驗證此方法的切實可行性。
　　(3)擬以REPLI-g WTA Single Cell Kit擴增毛囊微量細胞轉錄組基因，NEBNextDNA Library Prep Master Mix Set for Illumina試劑盒進行擴增后DNA建庫。通過NANO分光光度計、跑膠法觀察獲取轉錄組DNA的目的片段，PCR法、TA克隆等方法檢驗

9、擴增建庫水平，探討通過以上方法進行微量細胞建庫的可行性與效率。
　　對比AGA前額組（脫發(fā)臨界）、AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的基因表達譜分析，將進一步揭示AGA發(fā)病的毛囊干細胞機制，為開發(fā)AGA的新型靶向治療方案奠定基礎。
　　結果：
　　(1)通過測量毛囊單位的生長期毛囊數量以及生長期毛囊的長度發(fā)現，AGA前額組（脫發(fā)臨界）毛囊的長度小于AGA枕后部毛囊的長度(P=0.0014); AGA枕后部毛囊

10、的長度小于正常男性枕后部、正常女性枕后部毛囊的長度(P＜0.0001);而正常男性枕后組與正常女性枕后組無明顯差異。AGA前額部毛囊單位內生長期毛囊的根數比AGA枕部(P=0.0005)，正常男性枕部(P＜0.001)以及正常女性枕部(P＜0.001)都少，但其余三組之間無明顯差異。
　　(2)分別從毛囊的結構、干細胞、增殖等方面進行對比分析:CK14結構蛋白染色未見四個實驗組毛囊之間結構存在明顯差異;AGA枕后區(qū)、正常男性枕后區(qū)

11、及正常女性枕后區(qū)的CD200表達均位于毛囊隆突區(qū)位置，并且表達較強，AGA前額區(qū)隆突區(qū)域也明顯有CD200的陽性表達，但較其他組明顯減弱;AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的Ki67陽性表達主要分布在毛球部上方、毛囊下1/4至1/5處，且其的表達量不高，與正常表皮的增殖情況一致。而AGA前額組（脫發(fā)臨界）的Ki67陽性表達量明顯上調，且表達位置分布高至毛囊下1/2處，較其他組位置明顯增高。
　　(3)以人頭皮毛囊為實驗材

12、料時，同時選擇“顯微分離技術-酶消化”法作為標準化毛囊模型的的制備方法，這種方法制備的毛囊模型結構完整、純度高、損傷小。
　　(4)通過顯微分離技術、酶消化與免疫磁珠聯合法獲取的毛囊干細胞經過流式細胞儀分析、細胞涂片法染色等方法進行系統(tǒng)評價，發(fā)現這種分離純化毛囊干細胞的策略能進一步純化毛囊干細胞，細胞損失率降低。
　　(5)以構建的毛囊標準化模型為基礎獲得的細胞組群進行細胞含量分析，四個實驗組毛囊內所含CD200百分比個體差

13、異較大，有可能因為個體差異造成。但每個AGA患者自身比較發(fā)現，其枕后部毛囊CD200百分比含量均高于其前額部。
　　(6)通過AGA前額組（脫發(fā)臨界）、AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組四組間的基因表達譜分析，發(fā)現AGA枕后組基因表達譜與AGA前額（脫發(fā)臨界）組相近，與其他正常組差異明顯。說明AGA枕后區(qū)雖然不表現脫發(fā)病變，但它仍存在某些顯著缺陷。
　　結論：
　　(1)AGA患者前額組（脫發(fā)臨界）明顯出現生

14、長期毛囊減少，毛囊形狀變細、變短。而AGA枕后組較正常人（男、女）也出現了明顯的縮短。
　　(2)AGA前額組（脫發(fā)臨界）CD200干細胞表達量明顯減少，增殖細胞Ki67明顯增多。
　　(3)選擇“顯微分離技術-酶消化”法作為標準化毛囊模型的的制備方法，這種方法制備的毛囊模型結構完整、純度高、損傷小。
　　(4)通過顯微分離技術、酶消化與免疫磁珠聯合法獲取的毛囊干細胞能進一步純化毛囊干細胞，細胞損失率降低。