Vero細胞無血清培養(yǎng)基的研制及其在流感病毒培養(yǎng)中的應用.pdf

1、流行性感冒是人類至今不能有效控制的傳染病之一，每次流行都給人類的健康和經濟造成重大的損失。雖然有抗病毒藥物，但可能誘導耐藥株出現，不適合大范圍長時間來應對流行性感冒。目前接種疫苗仍被認為是預防流感的最好方法。傳統的流感疫苗以雞胚為培養(yǎng)基質，生產過程容易受到微生物的污染、不能大規(guī)模生產、對流感大流行應急能力差等，因此基于動物細胞為基質生產的流感疫苗成為疫苗發(fā)展的重要方向。非洲綠猴腎細胞系Vero是世界衛(wèi)生組織WHO推薦的人用疫苗生產基質，

2、目前已用于多種疫苗的生產，其安全性已得到認證。在流感大流行時，如何提高細胞培養(yǎng)技術水平以提高流感疫苗的產量和生產效率及病毒的培養(yǎng)條件成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及疫苗生產的目標和競爭核心。動物細胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)，將實現流感疫苗高效率、低成本的生產，成為流感疫苗開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。因此，本文借助統計學方法開發(fā)適用于Vero細胞生長的無血清培養(yǎng)基。
　　首先，本文通過連續(xù)運用單因素實驗—Plackett-Burman實驗—最陡爬坡實驗—中心

3、組合實驗5種統計學方法，建立了Vero細胞無血清培養(yǎng)基快速高效的開發(fā)技術。通過單因素實驗設計確定了胰島素、轉鐵蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生長因子、透明質酸和亞硒酸鈉在后續(xù)實驗中的添加濃度，考察的濃度范圍分別為胰島素3-6ug/mL，轉鐵蛋白7.5-15ug/mL、高密度脂蛋白10-20ug/mL、牛血清白蛋白2-4mg/mL、表皮生長因子50-100ng/mL、透明質酸15-30mg/mL、亞硒酸鈉4-8mmol/mL;進一

4、步通過Plackett-Burman實驗考察胰島素、轉鐵蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生長因子、透明質酸和亞硒酸鈉7種添加物對Vero細胞生長的影響作用大小，方差分析結果表明胰島素、牛血清白蛋白對Vero細胞的生長有顯著正影響作用(p＜0.05)，轉鐵蛋白、表皮生長因子、透明質酸有正影響作用(p＞0.05)，而高密度脂蛋白和亞硒酸鈉對細胞生長存在負影響作用;又通過最陡爬坡實驗拓寬胰島素、轉鐵蛋白、牛血清白蛋白的濃度范圍，3種添加

5、物的濃度分別為5.4ug/mL，13.8ug/mL，3.6mg/mL時，測定的OD490值最大;最后通過中心組合實驗確定胰島素、轉鐵蛋白和牛血清白蛋白的最佳濃度條件，分別為胰島素5.625ug/mL，轉鐵蛋白14.034ug/mL，牛血清白蛋白3.92mg/mL，按此條件配制的無血清培養(yǎng)基可支持Vero細胞的連續(xù)培養(yǎng)。
　　隨后，利用Vero細胞無血清培養(yǎng)培養(yǎng)體系，對Vero細胞培養(yǎng)H5N1流感病毒過程的MOI及TPCK-胰蛋白酶

6、的添加量進行優(yōu)化，自配無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)H5N1流感病毒的條件為:接種量MOI為0.001，TPCK-胰蛋白酶的添加量1ug/mE，并且每隔24h補加初始濃度的TPCK-胰蛋白酶。在優(yōu)化的H5N1流感病毒生產條件下，自配無血清培養(yǎng)基和Gibco商品化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)H5N1流感病毒的的HA及感染性滴度沒有顯著性差別，但都低于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基、自配無血清培養(yǎng)基和Gibco商品化無血清培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基培養(yǎng)出的病毒HA滴度分別為:5