大豆分離蛋白酶法改性及其在培養(yǎng)基中的應(yīng)用.pdf

1、本文系統(tǒng)研究了大豆分離蛋白的酶法水解，對其酶解產(chǎn)物進行了SDS-PAGE凝膠電泳分析，之后進行了酶解前后起泡性和乳化性的比較分析并將改性制品應(yīng)用于微生物培養(yǎng)基中。 本論文主要包括四個方面的內(nèi)容： 1. 大豆分離蛋白的酶解研究 對大豆分離蛋白進行單、雙酶酶解，以水解度作為綜合評價指標。用AS1.398中性蛋白酶進行酶解試驗，結(jié)果表明：最佳預(yù)處理條件為80℃、15min。單因素試驗研究結(jié)果表明，以4％(w/v)SPI

2、、4 000U/gSPI、50℃酶解4.5h時水解度較高，同時進行正交試驗優(yōu)化酶解條件，結(jié)果顯示，最佳酶解條件為4％SPI、6000 u/gSPI、55℃酶解4.5h；方差分析證實加酶量與溫度對酶解影響極為顯著(P<0.01)；酶解時間對酶解影響顯著(P<0.05)，而底物濃度對酶解影響不顯著(P>0.05)。用2709堿性蛋白酶進行酶解試驗，結(jié)果表明大豆分離蛋白經(jīng)70℃預(yù)處理10 min水解度明顯提高。單因素試驗表明以3％(w/v)底

3、物濃度、4000U/gSPI、50℃酶解4.5h水解度較好，并對底物濃度、酶解溫度和時間、加酶量等4因素進行正交試驗和方差分析，方差分析結(jié)果表明，加酶量和溫度對酶解影響顯著(P<0.05)，酶解時間與底物濃度影響不顯著(P>0.05)。為了提高酶解效率，進行雙酶配比、酶解pH值、溫度和時間4個單因素試驗和正交試驗，單因素結(jié)果表明以雙酶配比為1:3(AS1.398：2709)、pH 9.5、60℃和酶解3.5 h時對水解最為有利。正交試驗

4、和極差分析結(jié)果表明：雙酶配比(AS1.398：2709=1:1)對酶解影響最為顯著，其次為酶解溫度和pH值，酶解時間對酶解影響最不顯著。通過將三種不同的酶處理方法水解度進行比較，以雙酶復(fù)合酶解最好。 2. 酶解產(chǎn)物SDS-PAGE凝膠電泳分析 低分子量蛋白質(zhì)標樣標準曲線經(jīng)回歸分析得到方程為：y=-0.9446x+4.9637，相關(guān)性R<'2>=0.9986。大豆分離蛋白經(jīng)AS1.398酶解并進行SDS-PAGE凝膠電泳分

5、析顯示，隨著酶解時間的延長，色譜條帶會有所增加，在這部分條帶中，分子量一般聚集在14.4～60KD之間。2709堿性蛋白酶酶解液經(jīng)凝膠電泳分析顯示，相對于中性蛋白酶解液，色譜條帶有所增加，酶解后小分子物質(zhì)分子量聚集在14.4～31KD之間。大豆分離蛋白雙酶酶解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析顯示，隨著酶解時間的延長，蛋白質(zhì)譜帶增加，且在水解6h可以從產(chǎn)物圖譜中看到有31.8 KD和127.8KD兩條特征性譜帶。為了充分了解酶解過程，將

6、單、雙酶酶解產(chǎn)物在同一圖譜中進行SDS-PAGE電泳分析，研究結(jié)果證實，雙酶圖譜中條帶相對于單酶稍多，2709酶解產(chǎn)物SDS-PAGE凝膠圖譜中條帶相對于AS1.398稍多，這與水解能力有關(guān)。 3. 大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物乳化和起泡特性研究 大豆分離蛋白經(jīng)酶解后，進行乳化和起泡性研究。從水解度與起泡性關(guān)系可以得出，以雙酶復(fù)合酶解液的起泡性最強，其次為2709堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物，再次為AS1.398酶解產(chǎn)物，以大豆分離蛋白的

7、起泡性最差。從水解度與乳化關(guān)系可以得出，未經(jīng)酶解的大豆分離蛋白(CK)的乳化活性最高，其次為AS1.398和2709酶解產(chǎn)物，以雙酶復(fù)合酶解液的乳化活性最差。以最佳酶解條件下制備得到的酶解產(chǎn)物進行乳化性和起泡性研究(以未經(jīng)酶解的大豆分離蛋白作對照)，結(jié)果表明，起泡性隨水解度的增加而增加，而乳化性隨水解度的增加而減少。 4.蛋白胨在微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用 將雙酶酶解產(chǎn)物用不同的干燥方式進行干燥處理，發(fā)現(xiàn)以冷凍干燥得到的蛋白胨

8、結(jié)構(gòu)比較疏松，孔隙較大，水溶性較好，而紅外干燥和電熱干燥產(chǎn)品結(jié)構(gòu)較為緊密，水溶性較差。將單酶、雙酶復(fù)合酶解得到的產(chǎn)物應(yīng)用于培養(yǎng)基中并進行微生物生長測定，研究結(jié)果顯示，對于Bacillus subtilis 1398的生長，雙酶復(fù)合酶解液制備得到的蛋白胨(以下簡稱自制蛋白胨)最好；醋酸菌培養(yǎng)2～8h時，自制蛋白胨稍優(yōu)于購買的蛋白胨，培養(yǎng)8h之后，自制蛋白胨與購買的蛋白胨對微生物生長的影響區(qū)別不大；乳酸菌生長的2～6h時，自制蛋白胨要優(yōu)于購

9、買的蛋白胨，6h之后購買的蛋白胨對微生物生長情況要好；對于Bacillus subtilis NTG<,14>的生長，自制蛋白胨對生長有利。 以不同水解度(雙酶酶解產(chǎn)物)制備得到的蛋白胨分別配制培養(yǎng)基進行微生物生長的研究，結(jié)果表明，對于Bacillus subtilis 1398來說，培養(yǎng)4h時，以15％水解度生長要好，6h及以后均以20％水解度最好；醋酸菌和NTG<,14>培養(yǎng)4～12h過程中均以15％的水解度制得的蛋白胨最好