糖基化終產(chǎn)物介導(dǎo)糖尿病腎病腎臟脂質(zhì)沉積的分子機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 2型糖尿病大鼠腎臟膽固醇代謝異常
　　目的:本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于探索T2DM時(shí)腎臟脂質(zhì)沉積的分子機(jī)制，以及腎臟脂質(zhì)沉積能否影響腎臟形態(tài)和功能，最終促進(jìn)DN的發(fā)生和發(fā)展。
　　方法:SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，一部分大鼠維持普通飲食(Normal control，NC)，另一部分大鼠給予高脂高糖喂養(yǎng)4w后，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，30mg/

2、kg)。72h后，經(jīng)尾靜脈采血測定隨機(jī)血糖，以血糖≥16.7mmol/L確定為T2DM模型造模成功。再將成功造模的T2DM大鼠分為糖尿病組(DM)和阿托伐他汀治療組(10mg/kg/d,DM+AT)。
　　結(jié)果:1.DM組大鼠的體重明顯低于NC組大鼠(P＜0.05），腎重/體重(KW/WT)高于NC組大鼠(P＜0.05)，F(xiàn)BG也顯著高于對照組(P＜0.05），并且血脂，包括TG、TC和LDL也比NC組大鼠顯著增高(P＜0.05）

3、。AT治療8w后，與DM組相比，DM+AT組大鼠的體重、KW/WT和FBG改變不明顯（P＞0.05）;血TC和LDL明顯低于DM組(P＜0.05)，但TG改變不明顯(P＞0.05）。3.HE染色顯示，DM組大鼠腎臟出現(xiàn)空泡細(xì)胞，尤其在是腎小管上皮細(xì)胞，空泡現(xiàn)象比較明顯，而NC組大鼠的腎臟細(xì)胞并未發(fā)現(xiàn)空泡變性。進(jìn)一步油紅O染色發(fā)現(xiàn)，大量被染成橘紅色的脂滴沉積于腎臟，腎小管上皮細(xì)胞沉積尤為明顯，腎小球也存在脂質(zhì)沉積，而對照組大鼠的腎臟未發(fā)現(xiàn)

4、脂滴的形成。與此相比，DM+AT組只有少量的脂滴沉積于腎臟。PAS染色顯示DM組大鼠腎小球系膜基質(zhì)增生明顯，PASM染色顯示DM組大鼠的腎小球及腎小管基底膜均明顯增厚，而在NC組大鼠的腎組織未有發(fā)現(xiàn)系膜基質(zhì)增生及基底膜增厚的病理改變。AT治療8 w后，DM+AT組大鼠的腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小球及腎小管基底膜增厚明顯改善。4.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組大鼠腎臟組織HMG-CoAR、

5、LDLr、SREBP-2、SCAP的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于NC組(P＜0.05）。AT治療8w后，與DM組相比，DM+AT組大鼠腎臟組織HMG-CoAR、LDLr和SREBP-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05），而SCAP的mRNA和蛋白表達(dá)改變不明顯(P＞0.05）。
　　結(jié)論:1.T2DM大鼠腎臟存在脂質(zhì)沉積，而減少腎臟脂質(zhì)沉積可以明顯改善腎臟組織形態(tài)及功能。2.T2DM大鼠腎臟SCAP-SREBP-2-HMG

6、-CoAR/LDLr膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路紊亂，這可能與其腎臟脂質(zhì)沉積（腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞泡沫化）有關(guān)。
　　第二部分 糖基化終產(chǎn)物介導(dǎo)腎臟膽固醇代謝紊亂
　　目的:本研究將進(jìn)一步探索AGEs是否能夠引起T2DM時(shí)腎臟泡沫細(xì)胞形成，從而影響腎臟的形態(tài)和功能，最終導(dǎo)致DN。
　　方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將成功造模的T2DM大鼠分為糖尿病組(DM)和氨基胍治療組(100 mg/kg/d，DM+AG)。代謝籠收集大鼠24 h尿，檢測尿蛋白及

7、u-NGAL。藥物干預(yù)8w后，處死各組大鼠并留取血和腎組織標(biāo)本，檢測血清羧甲基賴氨酸(Carboxy-methyl-lysine，CML)。一部分腎組織制作冰凍切片用于油紅O染色，另一部分腎組織制作石蠟切片用于PAS染色、Masson染色及免疫組化。剩余腎組織用于定量Real-time PCR和Western blot檢測腎組織HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2及SCAP的基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1.與NC組

8、相比，DM組大鼠血清CML水平明顯增高（P＜0.05），而DM+AG組大鼠的血清CML明顯低于DM組(P＜0.05）。并且，免疫組化結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組腎臟的腎小管、腎小球、腎小球系膜、基底膜及腎間質(zhì)均有CML沉積，但AG干預(yù)8w后，與DM組相比，DM+AG組CML沉積明顯減少。2.油紅O染色結(jié)果顯示，與DM組相比，DM+AG組大鼠腎臟脂質(zhì)沉積減少。3.實(shí)驗(yàn)起初，DM組與DM+AG組的24 h尿蛋白總量沒有明顯差異(P＞0.0

9、5）。AG干預(yù)4w后，與DM組相比，DM+AG組的24 h尿蛋白總量明顯下降(P＜0.05)。AG繼續(xù)干預(yù)8w后，DM+AG組的24 h尿蛋白總量仍然比同期DM組的24 h尿蛋白總量低(P＜0.05）。AG干預(yù)8w后，DM+AG大鼠的24h尿u-NGAL含量也明顯降低（P＜0.05）。PAS和PASM染色結(jié)果顯示，與DM組相比，DM+AG組大鼠的腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小球及腎小管基底膜增厚明顯改善。4.Real-time PCR和Wes

10、tern blot結(jié)果顯示，DM+AG組大鼠腎臟組織HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表達(dá)也明顯比DM組低(P＜0.05）。
　　結(jié)論:1.T2DM時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞泡沫化，SCAP-SREBP-2-HMG-CoAR/LDLr膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路紊亂，與體內(nèi)高CML水平有關(guān)，這可能是腎臟形態(tài)及功能損傷的原因。2.抑制AGEs(CML)的合成或阻斷CML-RAGE通路，能夠減少腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)沉積

11、，改善腎臟形態(tài)及功能。
　　第三部分 糖基化終產(chǎn)物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致腎小管上皮細(xì)胞膽固醇代謝紊亂
　　目的:本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步于探究AGEs能否通過觸發(fā)腎小管上皮細(xì)胞ERS，從而引起SCAP和SREBP-2的表達(dá)及功能障礙，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)沉積。
　　方法:將HK-2細(xì)胞按照不同干預(yù)條件分為4組，分別為Ctr組、CML組(給予50μg/mL CML)、CML+4-PBA組(給予50μg/mL CML和5mmol/L

12、4-PBA)、4-PBA組(給予5 mmol/L4-PBA)。干預(yù)24h后，用CCK-8試劑盒和AnnexinⅤ-FITC試劑盒分別檢測HK-2細(xì)胞活力和凋亡情況，油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，酶學(xué)方法檢測HK-2細(xì)胞內(nèi)CE的水平，Real-time PCR和Western blot檢測HK-2細(xì)胞HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2、SCAP、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein78，GRP

13、78)及C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1.CML干預(yù)HK-2細(xì)胞24 h后，與Ctr組比較，CML組細(xì)胞活力下降(P＜0.05），而CML+4-PBA組較CML組細(xì)胞活力有所增加(P＜0.05）;單用4-PBA干預(yù)HK-2細(xì)胞24 h后，與Ctr組比較，細(xì)胞活力改變不明顯(P＞0.05）。CML干預(yù)HK-2細(xì)胞24h后，HK-2細(xì)胞凋亡數(shù)量較Ctr組有

14、所增加(P＜0.05)，而CML+4-PBA組較CML組細(xì)胞凋亡減少(P＜0.05）;單用4-PBA干預(yù)HK-2細(xì)胞24 h后，與Ctr組比較，細(xì)胞凋亡不明顯(P＞0.05）。2.與Ctr組相比，CML組CE值顯著增加(53.33±11.55μmol/L vs.116.67±32.15μmol/L，P＜0.05); CML+4-PBA組與CML組相比CE值顯著降低(116.67±32.15μmol/L vs.53.33±5.77，P＜0

15、.05);與Ctr組相比，4-PBA組的CE改變不明顯(53.33±11.55μmol/L vs.53.33±5.77肛mol/L，P＞0.05)。油紅O染色結(jié)果顯示有CML存在時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的紅染脂滴顯著增多，而CML+4-PBA組的紅染脂滴明顯比CML組減少;4-PBA組的HK-2細(xì)胞內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)紅染脂滴。3.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，CML組HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRN

16、A和蛋白表達(dá)明顯比Ctr組高(P＜0.05)，而CML+4-PBA組HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表達(dá)明顯比CML組低(P＜0.05);4-PBA組與Ctr組相比HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表達(dá)沒有明顯改變(P＞0.05）。CML組GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)明顯比Ctr組高(P＜0.05)，而CML+4-PBA組GRP78和CHOP的mRNA和蛋

17、白表達(dá)明顯比CML組低(P＜0.05);4-PBA組與Ctr組相比GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)沒有明顯改變(P＞0.05）。
　　結(jié)論:1.腎小管上皮細(xì)胞泡沫化，SCAP-SREBP-2-HMG-CoAR/LDLr膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路紊亂，這可能是由CML觸發(fā)腎小管上皮細(xì)胞ERS有關(guān)。2.而抑制ERS可以明顯改善CML引起的膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路的紊亂，從而減少腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)沉積。
　　總結(jié):T2DM時(shí)，體內(nèi)增