擬南芥G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（AtRGS1蛋白）的定位及在葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能研究.pdf

1、本研究以擬南芥野生型Col-0、突變體rgs1-2、gpa1-4、aba3和abi1、過表達(dá)35S：RGS1為材料，通過轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系構(gòu)建、差異顯示分析和雙突變體構(gòu)建分析等技術(shù)，用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、分子遺傳學(xué)等方法研究了AtRGS1蛋白在擬南芥葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用。取得了以下主要研究結(jié)果： 1、建立了擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞體系，并對AtRGS1蛋白及相關(guān)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了細(xì)胞定位根據(jù)AtRGS1蛋白的特有結(jié)構(gòu)，將編碼．AtRGS

2、1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行克隆表達(dá)，結(jié)合RGS1-GFP融合蛋白表達(dá)技術(shù)證明：AtRGS1蛋白定位于細(xì)胞膜，AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域和AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域分別定位于質(zhì)膜和細(xì)胞核。D-葡萄糖和ABA處理可以改變AtRGS1全蛋白的亞細(xì)胞定位，而AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域定位未發(fā)生改變。 2、篩選了AtRGS1蛋白介導(dǎo)的葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中特異表達(dá)的基因以擬南芥野生型Col-0和突變體rgs1-2為材料，運(yùn)用差異顯示技術(shù)篩選AtRG

3、S1蛋白介導(dǎo)的葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中特異表達(dá)的基因。經(jīng)反向Northern驗(yàn)證，得到四個(gè)差異表達(dá)蛋白，分別是擬南芥UDP葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(UGTs)、擬南芥γ谷氨酰水解酶、擬南芥蘇氨酸內(nèi)切酶、擬南芥ADP-核糖基化因子(ARF)。它們很可能是AtRGS1蛋白介導(dǎo)的葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的作用因子。其中ADP-核糖基化因子(ARF)可能和AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域具有相互作用，參與了AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域的遷移，而且可能將處于游離狀態(tài)的At

4、RGS1的C端結(jié)構(gòu)域通過胞內(nèi)運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，使其和跨膜結(jié)構(gòu)域重新融合。UDP葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是催化擬南芥內(nèi)源脫落酸(ABA)糖基化的一種酶，在外源高濃度葡萄糖處理后，其表達(dá)量降低，這就表明，外源高濃度葡萄糖處理導(dǎo)致內(nèi)源ABA分解的速度降低，從而促進(jìn)ABA抑制的種子萌發(fā)。而且，UDP葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶很可能是AtRGS1介導(dǎo)的葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中下游的效應(yīng)分子。 3、明確了擬南芥種子萌發(fā)對葡萄糖信號響應(yīng)過程中AtRGS1

5、的作用及其與ABA的關(guān)系(1)以擬南芥野生型Col-0為遺傳背景的突變體為材料，研究了AtRGS1蛋白在葡萄糖介導(dǎo)的種子萌發(fā)過程中的作用。結(jié)果顯示，與Col相比，AtRGS1過表達(dá)的35S：RGS1和Gα缺失突變體gpa1-4的種子萌發(fā)對D-葡萄糖的抑制作用表現(xiàn)為超敏感，而AtRGS1缺失突變體rgs1-2表現(xiàn)為低敏感。35S：RGS1、rgs1-2和Col-0種子萌發(fā)對葡萄糖類似物甘露糖的響應(yīng)無明顯差異。己糖激酶抑制劑NAG處理對葡萄

6、糖抑制種子萌發(fā)的效應(yīng)不明顯，但顯著降低了甘露糖對種子萌發(fā)的抑制作用。表明在種子萌發(fā)過程中，AtRGS1參與的葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一特殊途徑，且該途徑不依賴于己糖激酶。 (2)以AtRGS1缺失突變體rgs1-2、ABA合成突變體aba3、ABA響應(yīng)不敏感突變體abi1和雙突變體aba3rgs1-2、abilrgs1-2，以及野生型Col-0為材料，研究了葡萄糖介導(dǎo)的擬南芥種子萌發(fā)過程中AtRGS1與ABA3和ABI1的相互關(guān)系