補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59 CD46在T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究.pdf

1、目的:本研究采用siRNA技術(shù),構(gòu)建pSUPER-siCD46重組質(zhì)粒,與本室保存的pSUPER-siCD59重組質(zhì)粒,觀測CD46和CD59特異性沉默對T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,旨在探討CD59與CD46在T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的協(xié)同效應(yīng)。
　　 方法:構(gòu)建pSUPER-siCD46重組質(zhì)粒,利用PCR、質(zhì)粒雙酶切及DNA測序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,將細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞(Ⅰ組)、轉(zhuǎn)染pSUPE

2、R空質(zhì)粒Jurkat細(xì)胞(Ⅱ組)、轉(zhuǎn)染pSUPER-siCD59重組質(zhì)粒Jurkat細(xì)胞(Ⅲ組)和轉(zhuǎn)染pSUPER-siCD46重組質(zhì)粒Jurkat細(xì)胞(Ⅳ組),G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆。采用RT-PCR、Westernblot檢測各組細(xì)胞中CD46和CD59基因的表達(dá)。應(yīng)用CD59、CD46的單克隆抗體聯(lián)合作用于各組Jurkat細(xì)胞,MTT法測細(xì)胞增殖、WesternBlot測ZAP-70磷酸化的水平。
　　 結(jié)果:經(jīng)P

3、CR、限制性內(nèi)切酶雙酶切及測序鑒定,結(jié)果表明重組質(zhì)粒序列插入正確。重組質(zhì)粒pSUPER-siCD59和pSUPER-siCD46分別轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞,可表達(dá)綠色熒光蛋白,經(jīng)G418篩選,得到陽性細(xì)胞克隆:RT-PCR結(jié)果顯示:Ⅲ組CD59mRNA和Ⅳ組CD46mRNA的表達(dá)均被明顯抑制,與Ⅰ、Ⅱ組相比較(P＜0.05),差異有顯著性。CD59mAb、CD46mAb聯(lián)合作用于T細(xì)胞,Ⅰ組細(xì)胞的增殖能力,ZAP-70磷酸化條帶的灰度值

4、明顯高于Ⅲ、Ⅳ組,差異有顯著性(P＜0.05),,其中Ⅱ組低于Ⅲ組(P＜0.05),差異有顯著性,但Ⅰ、Ⅱ組之間比較(P＞0.05),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSUPER-siCD46;分別建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSUPER-siCD59、pSUPER-siCD46的Jurkat細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng);RT-PCR實(shí)驗(yàn)從mRNA水平證明重組質(zhì)粒pSUPER-siCD59和pSUPER-siCD46可分別特異性