HMGB1刺激下與RAGE胞內(nèi)段相互作用蛋白的鑒定.pdf

1、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是高遷移率族(HMG)蛋白家族成員之一,1973年英國(guó)科學(xué)家Goodwin在牛胸腺細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn),因其在聚丙烯酰胺電泳中的高遷移率得名,它是一種含量豐富、分子量小、高度保守的染色質(zhì)相關(guān)非組蛋白。HMGB1分布十分廣泛,多種器官細(xì)胞(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)中均有表達(dá),并位于大多數(shù)細(xì)胞的胞核和胞漿中。最初發(fā)現(xiàn)其作為DNA結(jié)合蛋白穩(wěn)定染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其具有豐富的生

2、物學(xué)功能,包括參與腦的發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、纖維蛋白溶酶原的活化、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞分化,廣泛參與全身的炎癥反應(yīng)和組織損傷以及動(dòng)脈粥樣硬化(AS)。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是西方發(fā)達(dá)國(guó)家的主要死亡原因。中國(guó),近年來,隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化、運(yùn)動(dòng)的缺乏和生活工作壓力的增大,我國(guó)心血管疾病發(fā)病率、死亡率均呈上升之勢(shì),已成為危害民眾生命的“第一殺手”,全國(guó)每年因冠心病死亡的患者達(dá)110萬人。1999年,Ross教授明確提出“動(dòng)脈粥樣硬化是一

3、種炎癥性疾病”。AS具有慢性炎癥的病理過程,其發(fā)生發(fā)展過程中始終伴隨著炎癥反應(yīng)。HMGB1在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究尚處于起步階段,目前尚無系統(tǒng)的報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1在人AS病變部位明顯增高,而且與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯相關(guān)。同時(shí)壞死的細(xì)胞也可以釋放大量的HMGB1。HMGB1可以和RAGE結(jié)合激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路,造成巨噬細(xì)胞聚集,形成正反饋環(huán)路,促進(jìn)AS病變發(fā)展。近來研究發(fā)現(xiàn):血清中HMGB1水平的增高和冠心病(CAD)之間呈正相關(guān)。多

4、變量逐步邏輯回歸分析:HMGB1和內(nèi)源性分泌型糖基化終末產(chǎn)物受體(esRAGE)是CAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥指標(biāo)C反應(yīng)蛋白(CRP)可以以劑量依賴的方式通過p38MAPK通路促進(jìn)HMGB1的產(chǎn)生,HMGB1又可以促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生,從而促進(jìn)血管壁的慢性炎癥。這些結(jié)果都支持HMGB1參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。而且巨噬細(xì)胞扮演重要的角色。
　　 RAGE是一種模式識(shí)別受體,是免疫球蛋白超家族的成員。RAGE和配體

5、的結(jié)合通過細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活下游的細(xì)胞信號(hào):反應(yīng)性氧自由基(ROS)、小GTP酶Ras、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等信號(hào)分子引起一系列的病理反應(yīng),造成前炎癥細(xì)胞的募集。在動(dòng)脈粥樣硬化部位激活的內(nèi)皮細(xì)胞,血管平滑肌細(xì)胞,巨噬細(xì)胞中RAGE的表達(dá)都上調(diào)。通過和配體的結(jié)合產(chǎn)生大量的促炎因子和細(xì)胞粘附分子。而且,RAGE可以募集白細(xì)胞到動(dòng)脈硬化的內(nèi)膜。通過RAGE的激活造成內(nèi)皮功能障礙,白細(xì)胞浸潤(rùn),氧化

6、應(yīng)激,血管炎癥。這些都依賴于RAGE介導(dǎo)的信號(hào)通路和基因的表達(dá)。RAGE和配體的相互作用在心血管病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用?？扇苄缘腞AGE可以競(jìng)爭(zhēng)性的抑制RAGE配體與RAGE的結(jié)合,減輕動(dòng)脈硬化的發(fā)展,最近研究表明:CAD患者血清中esRAGE水平下降和CAD相關(guān)。并且,esRAGE的水平和病變的冠狀動(dòng)脈數(shù)目負(fù)相關(guān)?？梢妰?nèi)源性的保護(hù)因子的減少和危險(xiǎn)因素一樣在糖尿病冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中扮演重要的角色。所以RAGE可能是治療動(dòng)脈

7、硬化的新靶點(diǎn)。
　　 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是糖尿病患者常見的并發(fā)癥和主要的死因,因此探討糖尿病冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。我們提出假說:在細(xì)胞外環(huán)境中的HMGB1分子可以作為旁分泌或自分泌因子通過和受體,主要是RAGE結(jié)合,引起重要信號(hào)通路的激活,活化單核細(xì)胞,造成單核細(xì)胞遷移到動(dòng)脈硬化的血管內(nèi)膜,遷入內(nèi)皮下間隙的單核細(xì)胞被激活并分化成巨噬細(xì)胞。OX-LDL、OX-Lp(a)可與巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體結(jié)合而被

8、攝取,泡沫細(xì)胞形成,加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。我們實(shí)驗(yàn)室側(cè)重細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究,因此我們十分關(guān)心RAGE下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 但是RAGE受到刺激后首先和哪種蛋白結(jié)合,如何將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至上述信號(hào)分子,目前尚無明確報(bào)道。RAGE胞內(nèi)段由41個(gè)富含負(fù)電荷的氨基酸組成,該段很可能在配體結(jié)合受體后,將信號(hào)傳遞給下游分子,產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。RAGE對(duì)下游信號(hào)分子的激活依賴其胞內(nèi)段結(jié)合的哪些蛋白?這個(gè)問題對(duì)闡明RAGE下游信

9、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。因此鑒定RAGE胞內(nèi)段結(jié)合的蛋白可以為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RAGE的下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)特定條件下相互作用的有效方法。其原理是:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí),完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。
　　 在本研究中我們選擇免疫共沉淀的方法獲得在HMGB1刺激下與目

10、的蛋白R(shí)AGE相互作用蛋白質(zhì)復(fù)合體,運(yùn)用經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)策略經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離。隨后用質(zhì)譜鑒定復(fù)合體中的組成成分。
　　 總之,我們通過免疫共沉淀技術(shù),得到了在HMGB1刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞后與RAGE胞內(nèi)段相互作用的蛋白,使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復(fù)合體并進(jìn)行差異蛋白條帶的分析,挖取差異蛋白條帶進(jìn)行MALDI FOF/TOF質(zhì)譜鑒定。本研究取得如下結(jié)果:
　　 1.純化得到了His-HMGB1融合蛋

11、白。
　　 2.通過Western blot檢測(cè)HMGB1刺激Raw264.7細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后MAPK信號(hào)通路的激活情況,選取了合適的刺激濃度和刺激時(shí)間點(diǎn)。
　　 3.免疫共沉淀得到了誘餌蛋白R(shí)AGE的富集。
　　 4.經(jīng)SDS—PAGE凝膠電泳分離蛋白復(fù)合體后分析差異蛋白條帶,選取差異蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,得到與RAGE相互作用的候選蛋白actin。
　　 5.鑒定出在HMGB1刺激下與RAGE細(xì)胞內(nèi)段

12、相互作用的蛋白-SLP76。
　　 6.明確RAGE與actin相互作用隨HMGB1刺激時(shí)間變化的趨勢(shì)。
　　 7.明確RAGE與SLP76相互作用隨HMGB1刺激時(shí)間變化的趨勢(shì)。
　　 綜上所述,本研究采用免疫共沉淀技術(shù)鑒定在HMGB1刺激下與RAGE的相互作用蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)了潛在的和RAGE的相互作用蛋白actin和SLP76,為進(jìn)一步研究RAGE蛋白信號(hào)通路的分子機(jī)制打下了良好的基礎(chǔ)。并為認(rèn)識(shí)HMGB1在動(dòng)脈