Necl家族蛋白胞外區(qū)的表達純化與胞內(nèi)區(qū)相互作用蛋白的篩查.pdf

1、Nectin—like(Necl，也稱為CADM或SynCAM)蛋白屬于免疫球蛋白超家族，共有5個成員，Necl1、Necl2、Necl3、Necl4和Necl5。其結(jié)構(gòu)相對保守，都含有由3個Ig—like結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)、單次跨膜區(qū)和一個短的胞內(nèi)區(qū)。Necl家族成員與Nectin家族成員，都是Ca2+非依賴性的細胞黏附分子，這些分子間存在著廣泛的同源或異源的相互作用。Necl家族分子是神經(jīng)系統(tǒng)特異表達或高表達的，通過同源或異源的相互

2、作用在細胞粘附、突觸形成、髓鞘發(fā)生等過程中起著重要的作用。已有研究表明，外周神經(jīng)系統(tǒng)中Necl1與Necl4間的相互作用對于施旺細胞形成髓鞘十分重要。而Necl2是一個腫瘤抑制因子并且可以調(diào)節(jié)突觸的形成。Necl家族分子間廣泛的相互作用正是其功能所必需的，而這種作用是由胞外區(qū)介導(dǎo)的并與其糖基化形式相關(guān)。在本實驗室的前期工作中，我們解析了Necl1胞外區(qū)第一個Vdomain的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Necl1胞外區(qū)第72位的苯丙氨酸對其形成二聚體很

3、重要。另有實驗室報道了Necl5的前兩個結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)以及其與脊髓灰質(zhì)炎病毒相互作用的位點。 本論文主要研究Necl1、Necl2、Necl3和Necl4四種蛋白胞外區(qū)的表達。實驗中選用了Bac-To—Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，這是一種通過位點特異的轉(zhuǎn)座作用產(chǎn)生用于表達的重組桿狀病毒的系統(tǒng)。從成年小鼠腦的cDNA中克隆出四種基因的編碼區(qū)，并將其插入到經(jīng)過改造的供體質(zhì)粒pFastBacTMDual—Hemolin/Gp67—3C

4、-His中。將構(gòu)建好的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10BacTM，在輔助質(zhì)粒的幫助下，供體質(zhì)粒與Bacmid發(fā)生同源重組，將外源基因片段插入到Bacmid中。重組的Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞，獲得用于表達的重組桿狀病毒。我們用低MOI值的P1代重組桿狀病毒感染Sf9細胞，擴增表達所需的病毒，并用實時定量PCR的方法測定病毒的滴度。 為了確定表達目的蛋白的最適宜條件，我們進行了一系列的實驗。首先，將帶有不同信號肽以及野生型和糖基化位

5、點突變型的Necl1的重組病毒感染昆蟲細胞，檢測不同的信號肽序列對外源蛋白的分泌量的影響，以及外源蛋白Necl1自身的糖基化位點對表達后修飾的影響。結(jié)果表明，實驗中所選用的分別帶兩種信號肽的外源蛋白的分泌無明顯差異，而Necl1蛋白不存在糖基化修飾。然后，比較了在相同感染條件下，Sf9和Sf21兩種細胞株的外源蛋白表達量是否存在差異。第三，采用兩種培養(yǎng)基及6種血清濃度進行外源蛋白的表達，優(yōu)化培養(yǎng)條件。第四，分別用不同MOI值的病毒感染S

6、f21細胞，確定用于感染的MOI值。第五，每24小時收取一次培養(yǎng)基上清，檢測外源蛋白分泌量與時間的關(guān)系。最終確定了外源蛋白的最適表達條件為Sf21細胞株、Grace'sinsectmedium培養(yǎng)基、2％胎牛血清、MOI為8的病毒量和3天的培養(yǎng)時間，并應(yīng)用此條件成功表達了四種蛋白。之后，我們用Ni柱對少量表達的外源蛋白進行初步純化，并用不同濃度的咪唑進行洗脫，最后選擇50mmol/L的咪唑濃度作為洗脫條件，獲得了較高純度的Necl4蛋白

7、胞外區(qū)產(chǎn)物。 Necl家族蛋白通過胞內(nèi)區(qū)與細胞內(nèi)信號通路發(fā)生作用。為了進一步研究Necl1蛋白的作用機制，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與Necl1胞內(nèi)區(qū)相互作用的蛋白。構(gòu)建含人Necl1蛋白胞內(nèi)區(qū)氨基酸編碼序列的誘餌質(zhì)粒pGBKT7—NECLIC，對人胎腦cDNA文庫進行酵母雙雜交篩選。酵母雙雜交陽性克隆經(jīng)測序后顯示共存在9段不同序列(存在重復(fù)克隆)。比對氨基酸序列得到5個可能的相互作用蛋白。并通過GSTpulldown實驗驗證