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文檔簡介
1、目的:
評(píng)價(jià)磁性納米顆粒作為基因載體介導(dǎo)小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)靶向沉默IGF1R對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的鼠心肌肥厚的抑制作用及其可能的機(jī)制。
方法:
檢索IGF-1R的基因序列,依照此序列構(gòu)建同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白基因(GFP)和特異性針對(duì)小鼠心肌細(xì)胞胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)基因的shRNA的質(zhì)粒pGFPshIGF-1R,共設(shè)計(jì)了兩條序列,用聚合物作為載體,將質(zhì)粒pGFPshlGF-1R轉(zhuǎn)
2、染進(jìn)鼠心肌細(xì)胞,篩選轉(zhuǎn)染效率較高的基因序列;根據(jù)上述篩選的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的鼠心肌細(xì)胞,同時(shí)與單純的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法相比較,通過western blot檢測兩種轉(zhuǎn)染方法對(duì)平滑肌細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達(dá)下調(diào)情況;外加磁場作用,篩選轉(zhuǎn)染效率最高的磁場參數(shù)。在去甲腎上腺素誘導(dǎo)的鼠心肌肥厚細(xì)胞及動(dòng)物模型中,通過心重/體重比、心肌橫截面積、心超檢測左室大小及心功能等評(píng)價(jià)心肌肥厚模型建立情況。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGFPshlGF-1R與聚合物的復(fù)合物,分子
3、水平用westernblot檢測聚合物載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后,組織中IGF-1R蛋白表達(dá)受抑情況;注射結(jié)束后1周,再次通過心重/體重比、心肌橫截面積、心超檢測左室大小及心功能等評(píng)價(jià)聚合物質(zhì)粒pGFPshlGF-1R體內(nèi)抑制心肌肥厚程度,并探索IGF1R下游信號(hào)通路蛋白活化情況。
結(jié)果:
首先通過測序驗(yàn)證了RNA干擾序列成功插入質(zhì)粒內(nèi),經(jīng)過western blot和RT-PCR檢測IGF1R表達(dá),篩選出序
4、列2為抑制效率較高的序列,對(duì)心肌肌細(xì)胞IGF-1R在mRNA水平和蛋白水平的抑制率分別達(dá)到47%±1.8%,和41%±1.2%。在轉(zhuǎn)染載體篩選方面,不論脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染還是應(yīng)用聚合物轉(zhuǎn)染方式,都可以將質(zhì)粒pGFPshlGF-1R轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)。相對(duì)于空白對(duì)照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,聚合物作為載體展現(xiàn)了較高的效率。流式細(xì)胞結(jié)果表明,綠色熒光蛋白基因(GFP)陽性的細(xì)胞數(shù)占35.1±3.1%,而在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組綠色熒光蛋白基因(GFP)陽性的細(xì)胞數(shù)只有1
5、3.0±5.1%;協(xié)同磁場轉(zhuǎn)染,在250mT輻照15min的條件下轉(zhuǎn)染效率最高,可以達(dá)到58%左右。在心肌肥厚模型的構(gòu)建上,通過去甲腎上腺素成功誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和小鼠心臟肥厚的模型,并檢測出IGF1R明顯增高、ANP及β-MHC的mRNA表達(dá)也明顯增高。在體內(nèi)轉(zhuǎn)染條件的實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)尾靜脈注射表達(dá)IGF1R shRNA的聚合物,能有效到達(dá)心肌組織,轉(zhuǎn)染24h、48h、72h均能明顯抑制IGF1R表達(dá),顯著減少去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚,改善心功
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