靶向PCNA基因的siRNA和shRNA抑制膀胱癌生長的體內外實驗研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，手術治療后仍有較高的復發(fā)率?，F(xiàn)階段，如何有效地治療膀胱癌并預防復發(fā)依然是基礎和臨床研究的重點和難點問題。RNA干擾現(xiàn)象被認識已有10年左右時間，但到目前為止，未發(fā)現(xiàn)哺乳動物有內源表達的小干擾RNA(siRNA)。一些研究者采用體外化學合成的方法獲得siRNA來進行腫瘤治療的研究，siRNA在細胞內作用時間較為短暫，適用于研究瞬時效應，不宜用來長期觀察RNA干擾后細胞生物學功能的變化。能夠表達短發(fā)夾結構R

2、NA(shRNA)的真核表達質?？梢钥朔iRNA作用時間短暫的缺點，研究者通過脂質體等輔助轉染方法將質粒轉入腫瘤細胞內，質粒在細胞內長時間表達shRNA，短發(fā)夾結構RNA在細胞漿內被Dicer酶切割加工成siRNA后發(fā)揮RNA干擾作用。近年來，RNA干擾技術為研究膀胱癌提供了一個全新的途徑。 惡性增殖是癌細胞的主要特征之一，長期以來，增殖細胞核抗原(PCNA)僅僅是用來判定包括膀胱癌在內的許多腫瘤惡性增殖程度和不良預后的標志物

3、，很少有研究者將PCNA直接與惡性腫瘤的治療聯(lián)系在一起，將PCNA基因作為小干擾RNA治療膀胱癌的靶基因國內外文獻未見有報道。本課題設計思路：首先，體外化學合成siRNA，通過脂質體包裹后轉染膀胱癌細胞，研究siRNA瞬時mRNA干擾效果以及對膀胱癌細胞生物學行為的影響，再根據(jù)siRNA的序列構建shRNA真核表達質粒載體，進一步研究shRNA表達質粒持久mRNA干擾效果以及對膀胱癌生長的影響，旨在通過檢測靶向PCNA基因的siRNA(

4、PCNA-siRNA)和shRNA(PCNA-shRNA)在體內外抑制膀胱癌生長的效果為治療膀胱癌并預防復發(fā)作出一些積極有益的探索。 第一部分：靶向PCNA基因的有效siRNA序列的篩選 目的：設計并篩選出靶向PCNA基因的有效siRNA序列，為后續(xù)研究提供依據(jù)。 方法：針對人類PCNA基因mRNA(NM-002592)序列設計并化學合成三條siRNA。選擇100nM作為siRNA的最佳終濃度，在siRNA轉染后

5、24、48、72和96小時用熒光定量RT-PCR(RTq-PCR)檢測T24細胞PCNA-mRNA表達水平的變化；在siRNA轉染后72小時用western-blotting檢測T24細胞PCNA蛋白表達水平的變化。 結果：3條PCNA-siRNA在轉染后48小時干擾效果最好，mRNA抑制率均在80％以上，其中PCNA-siRNA3抑制效果最好，mRNA抑制率高達90.2±1.7％。PCNA蛋白表達和mRNA表達水平的變化趨勢一

6、致。 結論：PCNA-siRNA1(靶位點291-309)、PCNA-siRNA2(靶位點550-568)和PCNA-siRNA3(靶位點679-697)均為有效序列。PCNA-siRNA3干擾效果最好。 第二部分：靶向PCNA基因的siRNA抑制膀胱癌生長的體外實驗研究 目的：探討PCNA基因表達瞬時抑制后T24細胞生物學行為的變化。 方法：選擇干擾效果最好的PCNA-siRNA3來抑制膀胱癌T24細胞

7、PCNA基因的表達，在PCNA基因表達抑制后用MTT檢測T24細胞生長抑制率，DAPI染色檢測T24細胞凋亡，F(xiàn)CM檢測T24細胞周期和凋亡，Transwell體外侵襲實驗檢測T24細胞體外侵襲能力。 結果：在轉染后第1、2、3、4、5天T24細胞生長抑制率，干擾組分別為23.7±2.8％、70.8±0.7％、69.8±0.4％、48.8±0.3％、31.7±0.2％，陰性對照組分別為2.4±0.9％、3.9±0.1％、5.8±

8、0.6％、12.2±0.4％、8.1±0.1％，干擾組T24細胞生長抑制率明顯高于陰性對照組，以第2、3天效果最佳；在轉染后第3天，干擾組多數(shù)視野可見少量的凋亡細胞，而空白對照組、陰性對照組視野內幾乎看不到凋亡細胞，流式細胞儀檢測干擾組細胞凋亡率為7.4±0.6％，較空白對照組和陰性對照組明顯增加，干擾組有更多的細胞被阻滯在S期和G1期；在轉染后第3天，Transwell體外侵襲實驗顯示：空白對照組、陰性對照組、干擾組穿過濾膜的細胞數(shù)分

9、別為95±7、90±8和為20±2。干擾組穿過濾膜的細胞數(shù)較空白對照組和陰性對照組少。 結論：PCNA-siRNA3有效地抑制了T24細胞增殖，在轉染后第2、3天抑制能力最強：在轉染后第3天，PCNA-siRNA3促進了T24細胞凋亡并有效地抑制了T24細胞體外侵襲能力，干擾組有更多的細胞被阻滯在S期和G1期。 第三部分：靶向PCNA基因的有效shRNA真核表達質粒的構建、鑒定和篩選 目的：構建靶向PCNA基因的

10、有效shRNA真核表達質粒，為體內研究提供依據(jù)。 方法：根據(jù)PCNA-siRNA1～3序列構建pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表達質粒。質粒啟動子為U6，含抗性篩選標記Neomycin同時可以表達綠色熒光蛋白。所得質粒用BamH I，Pst I分別酶切鑒定。委托上海英駿生物技術有限公司進行測序鑒定。通過G418篩選提高T24細胞質粒轉染效率，篩選后2周后獲得多克隆T24細胞，用熒光定量RT-PCR(RT

11、q-PCR)檢測多克隆T24細胞PCNA-mRNA表達，用western-blotting檢測多克隆T24細胞PCNA蛋白表達，選定有效shRNA真核表達質粒。 結果：pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表達質粒均為陽性重組載體且測序正確。篩選2周后質粒轉染效率>50％。T24-PCNA-shRNA3多克隆細胞PCNA-mRNA的表達抑制率達47.0±1.9％，明顯高于陰性對照組T24-shNC多克隆細胞的

12、1.8±0.7％。(p<0.05)。PCNA蛋白表達水平與mRNA表達水平的變化趨勢一致。 結論：成功構建pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表達質粒，pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA3持續(xù)有效地抑制了T24細胞PCNA基因的表達。 第四部分：靶向PCNA基因的shRNA抑制膀胱癌生長的體內實驗研究 目的：探討PCNA-shRNA3真核表達質粒在體內抑制膀胱癌生長的情況。

13、 方法：1、在右側脅腹部建立荷人膀胱癌BALB/c裸鼠移植瘤模型。裸鼠隨機分成3組，每組6只，分別為未處理組(瘤內未注射)、陰性對照組(瘤內注射shNC質粒20ug/鼠)和處理組(瘤內注射PCNA-shRNA3質粒20ug/鼠)。在接種T24細胞后第8、10、13、16、19、22、25天注射，共7次。于接種后第28天以斷頸法處死所有裸鼠。2、篩選PCNA-shRNA3相對穩(wěn)定表達T24多克隆細胞，在BALB/c裸鼠右側脅腹部接種P

14、CNA-shRNA3相對穩(wěn)定表達T24多克隆細胞，接種后第28天以斷頸法處死所有裸鼠。測量腫瘤體積，腫瘤組織作常規(guī)HE染色和免疫組織化學染色。 結果：1、未處理組和陰性對照組腫瘤生長較快，接種T24細胞后第28天，腫瘤表面張力大，有破潰的跡象，瘤體平均體積分別為761.3±149.9 mm3和718.3±75.1mm3，處理組腫瘤生長速度較慢，腫瘤表面無破潰的跡象，瘤體平均體積328.1±150.1mm3。未處理組和陰性對照組相

15、比差別無統(tǒng)計學意義，處理組與未處理組、陰性對照組相比差別均具有統(tǒng)計學意義。2、多克隆細胞組接種后第28天，4只裸鼠有肉眼可見腫瘤，最大直徑約4mm，2只未出瘤。4只裸鼠瘤體平均體積為6.8±1.6mm3，較未處理組明顯小。3、PCNA蛋白表達從強到弱依次為：未處理組與陰性對照組、處理組、多克隆細胞組。 結論：1、PCNA-shRNA3真核表達質粒持續(xù)有效地抑制了T24細胞皮下成瘤能力。2、PCNA-shRNA3真核表達質粒有效抑