鮭魚降鈣素在酵母中的多拷貝表達(dá)及安全性評價.pdf

1、十九世紀(jì)六十年代，降鈣素(Calcitonin，CT)作為一種降血鈣的物質(zhì)被copp發(fā)現(xiàn)。它在哺乳動物中起源于甲狀腺C細(xì)胞，在魚類中后腮體分泌。降鈣素是由哺乳動物的甲狀腺C細(xì)胞或魚類的后腮體分泌的多肽類激素，由32個氨基酸殘基組成，主要參與體內(nèi)的鈣、磷代謝。在體內(nèi)的主要作用是通過抑制破骨細(xì)胞活性，減少骨質(zhì)吸收，促進(jìn)鈣在骨中的沉積，從而降低血鈣濃度降鈣素的這種抗骨吸收活性使降鈣素能夠被廣泛的使用于治療Paget綜合癥，骨質(zhì)疏松，以及高鈣血

2、癥。不同來源的降鈣素氨基酸序列不同，其中后鰓體來源的降鈣素活性高于甲狀腺來源的降鈣素。鮭魚降鈣素(salmon calcitonin，sCT)的生物活性最高(4000IU/mg-7000IU/mg)，相當(dāng)于人降鈣素生物活性(200IU/mg)的30-40倍。由于降鈣素的天然來源有限，化學(xué)合成降鈣素成本較高，從而在一定程度上限制了降鈣素的普遍應(yīng)用。國內(nèi)外已有多個研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行了基因工程降鈣素的研究，并且已經(jīng)有產(chǎn)品在歐洲上市。多肽類藥物在過去

3、的二十年里得到了迅速的發(fā)展，但是降鈣素已經(jīng)開發(fā)的劑型只有注射和鼻腔給藥兩種形式，臨床主要采用注射給藥，患者長期用藥極為不便，依從性差，目前，國內(nèi)外均在加大鮭魚降鈣素口服劑的研究，以更大范圍的滿足臨床需求。由于多肽類藥物易于在胃腸中發(fā)生降解，因此，提高多肽抵抗蛋白酶降解能力便成為鮭魚降鈣素口服劑廣泛應(yīng)用的首要因素。近來，許多研究表明釀酒酵母對于多肽類藥物是一個合適的運(yùn)載載體。 釀酒酵母(Saccharomyces cerevis

4、iae)具有生長旺盛，易培養(yǎng)，生物量大，公認(rèn)安全等優(yōu)良特點(diǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的重要微生物之一。酵母基因組中rDNA片斷有100-200個重復(fù)單元，是提高外源基因的穩(wěn)定性和表達(dá)量，構(gòu)建多拷貝整合型載體較為理想的重復(fù)順序。2001年，Blanquet等成功實(shí)現(xiàn)了植物細(xì)胞色素P45073A1(生物體內(nèi)一種重要的酶)在酵母中的表達(dá)，提出了應(yīng)用釀酒酵母為載體實(shí)現(xiàn)藥物的口服給藥途徑，該方法制成的藥物被稱“biodrug”。在以酵母為載體的“biodrug

5、”模式研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥的重組酵母對人工模擬胃腸環(huán)境下的消化酶表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐受性，能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物能起到良好的保護(hù)作用，而且目前研究較多的口服型腸溶微粒模式證明，鮭魚降鈣素能夠以多肽的形式直接穿過動物胃腸道的表皮細(xì)胞進(jìn)入血液。本文以此為依據(jù)進(jìn)行了鮭魚降鈣素口服途徑的相進(jìn)行了鮭魚降鈣素口服途徑的相關(guān)研究，測定轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素酵母的體外活和體內(nèi)活性，為鮭魚降鈣素口服途徑應(yīng)用提供一個新的方法。 根據(jù)酵母整合質(zhì)粒的設(shè)計要求，PCR擴(kuò)增2

6、.2 kb rDNA片段，導(dǎo)入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)整合載體pYD1中，設(shè)計并合成適合在酵母中表達(dá)的鮭魚降鈣素(Salmon Calcitonin)，以此為目標(biāo)基因，構(gòu)建適合釀酒酵母多拷貝整合的表達(dá)載體p-r-sCT。通過載體p-r-sCT引入到釀酒酵母菌株EBYl00中，得到酵母重組菌株yAGA2-r-sCT，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了活性檢測。利用間接熒光標(biāo)記的方法，在熒光顯微鏡下觀察到了轉(zhuǎn)

7、化子yAGA2-V5和yAGA2-r-sCT外源蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的流式細(xì)胞儀分析顯示，表達(dá)開始12小時之后，yAGA2-sCT中有80％的細(xì)胞表達(dá)外源蛋白，yAOA2-V5轉(zhuǎn)化子中有52％的細(xì)胞表達(dá)外源蛋白。在腸激酶的作用下，轉(zhuǎn)基因酵母中的外源蛋白釋放到酶切液的上清當(dāng)中。該上清簡稱為EKS。外源表達(dá)的蛋白通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對其體外的活性進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)yAGA2-r-sCT EKS能夠顯著減少骨陷窩的生成，即重組鮭魚降鈣素能夠在體外抑制

8、破骨細(xì)胞的活性。體外降血鈣實(shí)驗(yàn)中，重組鮭魚降鈣素能夠明顯降低大鼠體內(nèi)血鈣濃度，證明重組鮭魚降鈣素具有體外活性。 取轉(zhuǎn)基因酵母分別以高(2g/kg)、中(0.5 g/kg)、低(0.1 g/kg)三種劑量組對高鈣血癥模型大鼠灌胃給藥，口服2g/kg冷凍干燥后的轉(zhuǎn)基因酵母可以使高鈣血癥模型Wistar大鼠的血鈣濃度由2.818±0.232 mM降低為2.475±0.019l mM。 口服轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母為鮭魚降鈣素的

9、應(yīng)用開辟了一條新的途徑。為評價轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母的安全性，將轉(zhuǎn)基因酵母分別灌胃昆明種小鼠和Wistar大鼠進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)(7天)、亞急性毒性實(shí)驗(yàn)(8周)。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示灌喂轉(zhuǎn)基因酵母對大鼠無致死效應(yīng)(LD50>10000 mg/kg)。亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中，高(2.0 g/kg)、低(0.5 g/kg)劑量組動物的一般狀況、體重、主要臟器系數(shù)、血液學(xué)指標(biāo)及血液生化指標(biāo)與各對照組比較，均未見明顯差異(p>0.05).組織病理切片檢查