轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母對骨質(zhì)疏松和血管鈣化作用的研究.pdf

1、降鈣素(calcitonin，CT)是一種32個氨基酸組成的多肽類激素。臨床應用鮭魚降鈣素(salmon calcitonin，sCT)治療骨質(zhì)疏松，而現(xiàn)有給藥途徑僅僅注射和鼻噴兩種，且昂貴的價格也限制了它在我國的普及。實現(xiàn)鮭魚降鈣素的口服給藥(轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母yAGA2-sCT)將是最為理想的選擇。 為研究轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母(yAGA2-sCT)對骨質(zhì)疏松大鼠的作用，我們建立了骨質(zhì)疏松大鼠模型，觀察sCT和yAGA2-s

2、CT對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度、骨形態(tài)計量學影響；同時檢測血鈣、血堿性磷酸酶、血清骨鈣素、血清胰島素樣生長因子-1以及尿鈣、羥脯氨酸等經(jīng)典的骨代謝生化標志物水平以觀察sCT和yAGA2-sCT對骨代謝的影響。實驗分假手術組、模型對照組、sCT組及yAGA2-sCT組。通過大鼠股骨X光照片、光鏡觀察及骨密度值檢測說明骨質(zhì)疏松大鼠造模成功。sCT組及yAGA2-sCT組的腰椎和股骨骨密度及骨代謝生化標志物水平明顯得到改善，提示sCT及yAGA2-

3、sCT通過抑制骨吸收從而抑制了骨質(zhì)疏松。sCT組及yAGA2-sCT組兩組比較差異無顯著性，提示口服yAGA2-sCT與sCT注射液對骨質(zhì)疏松大鼠有相似的作用，均具有干預骨重建、抑制骨質(zhì)疏松的作用。 為進一步探討轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母(yAGA2-sCT)對骨質(zhì)疏松的作用機制，我們觀察了yAGA2-sCT對體外成骨細胞的作用。應用酶消化-連續(xù)組織塊法體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞，觀察sCT和yAGA2-sCT對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖、分化、

4、礦化功能的影響。經(jīng)病理學檢查及染色證實體外培養(yǎng)成骨細胞成功；sCT及yAGA2-sCT對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞的增殖、分化和礦化功能具有刺激作用。 眾所周知老年患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的同時常常伴發(fā)血管鈣化。近來認為三個新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族成員骨保護素(Osteoprotegrin，OPG)，核因子kB受體激活物配體(Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)和

5、核因子kB受體激活物(Receptor aCtivator of nuclear factor kappaB，RANK)，亦稱OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)，參與骨質(zhì)疏松和血管鈣化的調(diào)節(jié)過程，是這兩種伴發(fā)疾病之間的分子聯(lián)系。 為研究OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在血管鈣化中的調(diào)節(jié)作用以及降鈣素對OPG/RANKL/RANK途徑的干預作用，本實驗建立了大鼠動脈鈣化模型，病理學觀察血管鈣化情況，測定血管組織中鈣含量及堿性磷酸酶活

6、性，免疫組化法檢測OPG和RANKL在血管組織中的表達。實驗分對照組、模型組、sCT組及yAGA2-sCT組。病理學觀察成功建立維生素D3誘發(fā)的血管鈣化模型；與對照組比較，鈣化血管組織中鈣含量及堿性磷酸酶活性增高；模型組血管壁OPG表達明顯減少而RANKL表達明顯增加。與模型組比較，sCT組和yAGA2-sCT組血管鈣化程度明顯減輕，血管壁OPG表達明顯增加而RANKL表達明顯減少。提示OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)參與血管鈣化的調(diào)節(jié)

7、，sCT和yAGA2-sCT可通過OPG/RANKL/RANK途徑有效抑制血管鈣化。 為進一步觀察RANKL對大鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)體外鈣化的調(diào)節(jié)作用及降鈣素對其調(diào)節(jié)作用的影響，我們體外培養(yǎng)大鼠VSMC，建立體外VSMC鈣化模型，在培養(yǎng)介質(zhì)中分別加入RANKL及降鈣素，觀察細胞鈣沉積及細胞減性磷酸酶活性、骨鈣素的變化情況。VSMC經(jīng)von Kossa染色證實動脈鈣化

8、模型成功建立。實驗分對照組、鈣化模型組、RANKL組、sCT組及yAGA2-sCT組。鈣化模型組、RANKL組、sCT組及sCT組鈣沉積、堿性磷酸酶活性、骨鈣素水平明顯高于對照組；與鈣化模型組比較，RANKL組鈣沉積、堿性磷酸酶活性、骨鈣素水平均明顯增高；與RANKL組比較，sCT組和yAGA2-sCT組鈣沉積、堿性磷酸酶活性、骨鈣素水平明顯降低。提示RANKL促進鈣化培養(yǎng)的VSMC鈣沉積、堿性磷酸酶活性及骨鈣素的表達，而sCT和yAG