鮭魚降鈣素及其變異體在大腸桿菌中的高效表達(dá)及重組多肽的性質(zhì)研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文鮭魚降鈣素及其變異體在大腸桿菌中的高效表達(dá)及重組多肽的性質(zhì)研究姓名：劉深基申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生化及分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳松森19991001中田協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文： 摘要f ∞了便于裂解后小肽的分離純化，我們用定點(diǎn)突變的方法將T r x ．s C T ．G 1 y 基因第3 8 位M e t 突變?yōu)锳 l a ，并將突變后的基因克隆于p E T 3 0 a 載體的N d e I 和H i n dI

2、 I I 切點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌體B L 2 1 中，在I P T G 的誘導(dǎo)下，融合蛋白T r x ．s C T ．G l y的表達(dá)水平可達(dá)到5 6 ％。在研究表達(dá)條件時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了表達(dá)“滲漏現(xiàn)象”，即細(xì)菌在未加誘導(dǎo)荊的條件下較長時(shí)間培養(yǎng)能夠離水平地表達(dá)目的蛋白。在我們的表達(dá)體系中，工程菌株在對(duì)數(shù)生長階段并沒有或很少表達(dá)外源蛋白，只有當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間足夠長時(shí)，才能積累大量的目的蛋白。2 0 小時(shí)培養(yǎng)后，菌體內(nèi)目的蛋白的表達(dá)水平可達(dá)到菌體總蛋白

3、的5 1 ％，菌體總量可達(dá)到每升培養(yǎng)基收獲8 一l O g 濕菌體，因而這樣的“表達(dá)滲漏”現(xiàn)象對(duì)于大量制各重組蛋白具有很重要的應(yīng)用價(jià)值。用T h i o B i n d 親和樹脂純化表達(dá)的蛋白，結(jié)果說明3 8 位的M e t 突變?yōu)锳 l a 不影響融合蛋白與樹脂的特異性結(jié)合，純化的目的蛋白純度可達(dá)到9 0 ％以上。優(yōu)選C N B r裂解融合蛋白的條件，確定在含有3M 的尿素的7 0 ％的甲酸中，室溫4 8 小時(shí)，融合蛋白裂解較好，至少

4、8 0 ％的蛋白被C N B r 裂解開。s C T - G I y 的分離純化是另外一個(gè)難點(diǎn)，不僅因?yàn)槠浞肿有?，而且在許多分離介質(zhì)上有嚴(yán)重的非特異性吸附。在實(shí)驗(yàn)中我們采用了C M 一纖維索作為分離介質(zhì)，避免了非特異性吸附，而且用O ．1 5 N 鹽酸解吸附可以在冷凍干燥時(shí)去掉，避免了脫鹽時(shí)的麻煩。該方法可以得到純度為9 2 ％的s C T ．G l y ，且產(chǎn)率也達(dá)9 0 ％以上。N 一末端1 0 個(gè)氨基酸的序列分析說明，表達(dá)、分離的

5、產(chǎn)物與預(yù)期一致。在強(qiáng)酸性條件下，沒有發(fā)生氨基酸的脫酰胺反應(yīng)。氨基酸組成分析與預(yù)期基本一致。質(zhì)譜法測定的分子量為3 4 9 2 道爾頓，毛細(xì)管電泳! 測定等電點(diǎn)為6 ．4 6 ，大鼠降血鈣活性為1 9 0 I U ／m g左右，與天然的人降鈣素相當(dāng)。此研究為用基因工程的方法生產(chǎn)蘑組s C T 打下了良好的基礎(chǔ)，7 ”一三．人源化鮭魚降鈣素的構(gòu)建與表達(dá)·f 鮭魚降鈣素雖然是一種安全有效的骨代謝藥物，但是長期使用會(huì)刺激人體產(chǎn)生特異性

6、抗體，其影響可能涉及到副作用的發(fā)生和療效的降低。為了降低其免疫原性，我們設(shè)計(jì)并構(gòu)建了人源化鮭魚降鈣素( 1 1 ．1 5 ’) h s C T 。并將該基因克隆于p T r x F u s 表達(dá)載體中，在色氨酸的誘導(dǎo)下，獲得高效可溶性表達(dá)，表達(dá)水平為4 6％以上。用滲透壓法處理，能得到純度較高的融合蛋白。初步活性測定結(jié)果表明，( 1 1 —1 7 ) 人源化的鮭魚降鈣素保存了鮭魚降鈣素前體活性的一半以上。定量W e s t e mB l