多拷貝人-鮭嵌合降鈣素在釀酒酵母中表達(dá)優(yōu)化及安全性評(píng)價(jià)研究.pdf

1、降鈣素(Calcitonin，CT)是由32個(gè)氨基酸殘基組成的多肽類激素，在體內(nèi)的主要作用是通過抑制破骨細(xì)胞活性，減少骨質(zhì)吸收，促進(jìn)鈣在骨中的沉積，從而降低血鈣濃度，被廣泛的使用于治療Paget綜合癥，骨質(zhì)疏松和高鈣血癥。研究表明，凍干的酵母作為多肽類藥物載體可以抵抗蛋白酶降解能力，降鈣素能夠以多肽的形式直接穿過動(dòng)物胃腸道的表皮細(xì)胞進(jìn)入血液。因此，本實(shí)驗(yàn)室的孫平楠和姜勇等人前期分別構(gòu)建了兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母yAGA2-sCT和

2、yAGA2-r-sCT，均成功實(shí)現(xiàn)了鮭魚降鈣素的口服給藥。為了進(jìn)一步提高降鈣素的表達(dá)量和生物活性，本研究將5拷貝人/鮭嵌合降鈣素基因(5hsCT)，以rDNA作為同源重組位點(diǎn)多拷貝整合到釀酒酵母基因組中，并對(duì)其的表達(dá)條件和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，為實(shí)現(xiàn)口服降鈣素藥物生產(chǎn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本研究通過HpaI酶切表達(dá)載體pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1獲得線性

3、rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1片段，以rDNA為同源重組位點(diǎn)將ura3標(biāo)記基因和帶有磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(PGK promoter)的五拷貝人-鮭嵌合降鈣素基因(5hsCT)引入到尿嘧啶缺陷型釀酒酵母菌株YS-△ura中，得到酵母重組菌株YS-5hsCT。Southern blotting顯示5拷貝人-鮭嵌合降鈣素基因(5hsCT)成功整合到釀酒酵母的基因組中，整合拷貝數(shù)為多拷貝。Western blotting

4、結(jié)果表明，人/鮭嵌合降鈣素在重組菌株YS-5hsCT中表達(dá)，經(jīng)ELISA檢測其表達(dá)量占酵母總蛋白的2.05％。通過轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT的降血鈣活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)口灌胃0.01 g/kg轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的小鼠，其血鈣值比正常小鼠的血鈣值下降了0.498 mM，證明了具有體內(nèi)生物活性。
　　通過人/鮭嵌合降鈣素基因5hsCT轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平分析優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT表達(dá)條件;并研究了單一外界因子對(duì)轉(zhuǎn)基因釀酒酵母Y

5、S-5hsCT生長的影響;最后通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因子對(duì)5hsCT蛋白在轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT中表達(dá)條件的綜合優(yōu)化，結(jié)果表明:(1)5hsCT基因表達(dá)的最優(yōu)時(shí)間為96 h，最優(yōu)溫度為30℃，最優(yōu)轉(zhuǎn)速為225 rpm。(2)單一外界因子實(shí)驗(yàn)得出適宜轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT生長的條件為:初始接種量為8％，培養(yǎng)時(shí)間為72 h，培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200～250rpm，通氣量為7.0～8.5 l/min。(3)通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)5

6、hsCT蛋白在轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT表達(dá)的培養(yǎng)條件進(jìn)行綜合優(yōu)化，得出最優(yōu)化組合為:初始接種量為8％，培養(yǎng)時(shí)間為72 h，培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為225rpm，通氣量為7.0 l/min。在最優(yōu)化組合條件下，在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)5hsCT蛋白占總蛋白的2.08％，釀酒酵母YS-5hsCT-3的生物量為7.51 g/l·d，推算出5hsCT蛋白產(chǎn)量為156.21mg/l·d。
　　對(duì)表達(dá)人/鮭嵌合降鈣素的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5

7、hsCT進(jìn)行了毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括急性毒性實(shí)驗(yàn)、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)（小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)）、傳統(tǒng)致畸實(shí)驗(yàn)和30天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示LD50≧10.0 g/kg，表明轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT屬于實(shí)際無毒物質(zhì);遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠紅細(xì)胞微核率和精子畸形率與溶劑對(duì)照組相比，沒有顯著差異且無劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT不具有遺傳毒性，沒有致突變作用;傳統(tǒng)致畸實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示灌胃轉(zhuǎn)基因酵母YS-5hsC

8、T的孕鼠生長發(fā)育良好，對(duì)所產(chǎn)小鼠胚胎外觀和胎鼠內(nèi)臟和骨骼觀察無致畸現(xiàn)象，表明轉(zhuǎn)基因酵母沒有對(duì)孕鼠產(chǎn)生母體毒性，對(duì)母鼠的生殖機(jī)能沒有不良影響，對(duì)小鼠胚胎發(fā)育無致畸作用;30天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠增重、血液和血液生化指標(biāo)、臟器系數(shù)均在正常范圍內(nèi)，與對(duì)照組均無顯著差異(P＞0.05)，臟器組織切片檢查未發(fā)現(xiàn)病理性變化。因此轉(zhuǎn)基因酵母YS-5hsCT未對(duì)小鼠無影響，是安全無毒的。
　　本研究首次獲得了無抗生素標(biāo)記的重組降鈣素釀酒酵母菌株，該菌株