養(yǎng)殖中華鱘卵黃發(fā)生初步研究.pdf

1、中華鱘(AcipensersinensisGray)為典型的溯河產(chǎn)卵洄游魚類，是現(xiàn)生27種鱘形目魚類中分布最南部的種類，主要分布于我國(guó)東海、黃海、珠江和長(zhǎng)江干流。在海水中生長(zhǎng)成熟，在淡水中繁殖。近年來(lái)由于水污染、大型水利工程等因素的影響，野生中華鱘鱘資源量急劇下降。目前野生中華鱘人工繁殖技術(shù)已經(jīng)取得成功，這對(duì)人工增殖放流的實(shí)施具有重要作用。另?yè)?jù)報(bào)道中華鱘全人工繁殖技術(shù)于2009年獲得初步進(jìn)展，但對(duì)中華鱘性腺發(fā)育規(guī)律以及影響到中華鱘幼魚發(fā)

2、育到成熟過(guò)程中至關(guān)重要的卵黃發(fā)生過(guò)程尚未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。本論文通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖中華鱘性腺的組織學(xué)觀察和卵黃發(fā)生過(guò)程的電鏡觀察，并采用分子生物學(xué)手段從微觀水平來(lái)印證中華鱘內(nèi)源性和外源性卵黃來(lái)源途徑，對(duì)中華鱘組織中卵黃物質(zhì)之一卵黃磷蛋白的前體-卵黃蛋白原合成部位進(jìn)行了分析，主要得出以下結(jié)果：
　　 1、對(duì)目前長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖中華鱘進(jìn)行性腺發(fā)育監(jiān)測(cè)，本實(shí)驗(yàn)采到的中華鱘最大個(gè)體為1999年人工繁殖的子一代，即10年齡。此時(shí)的卵母細(xì)胞最大直徑可達(dá)到

3、500um，大部分介于200-400um之間。這些細(xì)胞外圍出現(xiàn)一層濾泡層，個(gè)別有兩層。組織學(xué)觀察表明養(yǎng)殖中華鱘雌性個(gè)體性腺發(fā)育仍處于Ⅱ期，個(gè)別性腺發(fā)育可能達(dá)到了Ⅱ期末向Ⅲ期轉(zhuǎn)化的過(guò)程。因此，卵黃的發(fā)生和積累是中華鱘性腺成熟的關(guān)鍵。
　　 2、通過(guò)光鏡和透射電鏡對(duì)中華鱘早期卵黃發(fā)生過(guò)程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)中華鱘也存在內(nèi)源性和外源性卵黃發(fā)生過(guò)程。結(jié)果表明：中華鱘的卵黃發(fā)生起始于初級(jí)卵母細(xì)胞，并且在卵原細(xì)胞時(shí)期就觀察到卵子發(fā)生的特征物--類

4、核周體；而且，可以根據(jù)類核周體在胞質(zhì)中分布與線粒體的關(guān)系將早期卵母細(xì)胞劃分為不同發(fā)育時(shí)期。在初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育早期，類核周體逐漸消失，線粒體增多，細(xì)胞外具有質(zhì)膜和結(jié)締組織。初級(jí)卵母細(xì)胞后期，卵黃核消失，通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器參與了中華鱘的卵黃形成過(guò)程，在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了卵黃顆粒和脂滴，隨后卵黃顆粒相互融合形成大卵黃顆粒。通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)膜的微觀觀察，發(fā)現(xiàn)外源性卵黃物質(zhì)主要通過(guò)質(zhì)膜的微吞飲作用和微絨毛的吸收作用進(jìn)入卵

5、母細(xì)胞，并且與卵母細(xì)胞內(nèi)已有卵黃顆粒融合形成大卵黃顆粒。
　　 3、對(duì)中華鱘內(nèi)源性和外源性卵黃來(lái)源問(wèn)題進(jìn)行分子生物學(xué)印證，本實(shí)驗(yàn)以1-10齡雌性中華鱘和6個(gè)年齡段雄魚為實(shí)驗(yàn)材料，先根據(jù)組織學(xué)觀察確定其發(fā)育狀況。再?gòu)闹腥A鱘不同年齡段性腺和肝臟中提取總RNA，用RT-PCR方法初步探討了不同年齡段中華鱘卵巢和肝臟中卵黃蛋白原mRNA的表達(dá)，確定是否存在卵黃蛋白原的合成功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：中華鱘雌性和雄性個(gè)體性腺中均存在卵黃蛋白原mRNA

6、的表達(dá)。對(duì)1-10齡中華鱘雌魚性腺觀察發(fā)現(xiàn)，其性腺組織中是存在卵黃蛋白原mRNA的表達(dá)，并且表達(dá)量隨著年齡呈不斷增加的趨勢(shì)。1齡、2齡時(shí)表達(dá)量最弱，至出現(xiàn)較微弱條帶，10齡中華鱘性腺中卵黃蛋白原mRNA表達(dá)量最強(qiáng)，其表達(dá)強(qiáng)度明顯高于其他年齡段，且明顯高于性腺已達(dá)Ⅳ期成熟的野生中華鱘性腺中卵黃蛋白原mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，10齡中華鱘雌魚隨著卵巢的發(fā)育已進(jìn)入卵黃蛋白原合成的增強(qiáng)期。由于受到材料的限制，只對(duì)1-7齡中華鱘肝臟中卵黃蛋白

7、原mRNA表達(dá)量進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示除1齡以外的2-7齡的中華鱘雌魚肝臟中都存在卵黃蛋白原mRNA的表達(dá)，并且表達(dá)量之間不存在明顯差異；本實(shí)驗(yàn)還對(duì)1齡，3齡，4齡，5齡，9齡，12齡中華鱘雄性個(gè)體性腺進(jìn)行了卵黃蛋白原mRNA表達(dá)情況的分析，發(fā)現(xiàn)除1齡以外其他年齡中華鱘雄性個(gè)體性腺中是存在卵黃蛋白原mRNA的表達(dá)，并且表達(dá)量之間不存在明顯差異，結(jié)果說(shuō)明了在中華鱘雄性個(gè)體中正常情況下存在少量卵黃蛋白原，這也證實(shí)了精巢中VTG是為精子發(fā)生提供