中華鱘幾個(gè)生殖細(xì)胞相關(guān)基因的克隆和表達(dá)特征研究.pdf

1、中華鱘(Acipense sinensis)為瀕危物種,國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物;其性成熟期長(zhǎng)達(dá)10年以上,且發(fā)育不同步。雖然其全人工繁殖于2009年已實(shí)現(xiàn),但此種方法需要對(duì)其親本長(zhǎng)期養(yǎng)殖,需要投入大量的人力、物力和財(cái)力,而且還存在親魚(yú)死亡等多種風(fēng)險(xiǎn),因此,有必要尋求其他辦法對(duì)該物種進(jìn)行多途徑的保護(hù)。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,生殖細(xì)胞移植被認(rèn)為是一種周期短而且有效的方法,在魚(yú)類(lèi)中有成功應(yīng)用的報(bào)道。該種方法的實(shí)施需要首先找到生殖細(xì)胞的標(biāo)記基因

2、。另外,到目前為止,關(guān)于中華鱘性別分化、生殖調(diào)控的分子機(jī)制的相關(guān)信息,依然十分有限。鑒于此,本研究通過(guò)同源克隆的方法,在中華鱘中得到4個(gè)已知在生殖細(xì)胞或/和生殖干細(xì)胞中起重要作用的基因(pou2、nanos1、dazl和boule)的全長(zhǎng)cDNA序列;運(yùn)用RT-PCR技術(shù),研究它們?cè)谥腥A鱘不同組織和/或不同胚胎發(fā)育時(shí)期和/或不同年齡性腺中的表達(dá)特征。另外,將中華鱘nanos1基因進(jìn)行原核表達(dá),制備多克隆抗體,運(yùn)用Western Blot

3、研究中華鱘Nanos1蛋白在不同組織中的表達(dá);通過(guò)免疫熒光定位,研究中華鱘Nanos1蛋白在性腺中細(xì)胞的表達(dá)部位。主要研究結(jié)果如下:
　　1.脊椎動(dòng)物中,第Ⅴ類(lèi)POU基因家族成員包括:pou5f1和pou2,其編碼的產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子起著維持胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞多能性的作用。中華鱘pou2基因(Aspou2)的全長(zhǎng)cDNA序列為2853 bp,其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?296 bp,編碼431個(gè)氨基酸,5’非編碼區(qū)為489 bp

4、,3’非編碼區(qū)為1068 bp。通過(guò)將AsPou2與其他物種第Ⅴ類(lèi)POU家族基因氨基酸序列的多重比對(duì),發(fā)現(xiàn)第Ⅴ類(lèi)POU家族成員均含有一個(gè)非常保守的POU結(jié)構(gòu)域。AsPou2 POU結(jié)構(gòu)域與青鳉的氨基酸序列一致性最高,達(dá)到了90％,其次為斑馬魚(yú)(88%),爪蟾(69%),小鼠(67%)和人類(lèi)(67%)。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),除肝臟外,Aspou2 mRNA在脾臟、心臟、卵巢、脂肪、腎臟、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦都表達(dá)

5、,而在肌肉、垂體和腦中的表達(dá)量較高。Aspou2為母源表達(dá),且在胚胎發(fā)育過(guò)程中,其表達(dá)量逐漸降低,出膜后一天不表達(dá)。另外,還發(fā)現(xiàn)隨著性腺的發(fā)育,Aspou2的表達(dá)量增加。這些結(jié)果表明Aspou2可能在體細(xì)胞、多能干細(xì)胞、胚胎和性腺發(fā)育的過(guò)程中扮演著重要的角色。
　　2. nanos基因家族成員在種系細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。本研究通過(guò)同源克隆的方法,得到了中華鱘nanos1基因(Asnanos1)的全長(zhǎng)cDNA序列。該序列為7

6、75 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)闉?87 bp,編碼228個(gè)氨基酸,5’非編碼區(qū)長(zhǎng)88 bp,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)3’非編碼區(qū)。通過(guò)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn),AsNanos1有一個(gè)非常保守的鋅指結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),除脂肪外,Asnanos1 mRNA在脾、心、卵巢、肝、腎、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦中有表達(dá)。另外,將AsNanos1原核表達(dá),獲得純化的重組蛋白,免疫家兔,成功制備有效的多克隆抗體。Western Blot分析發(fā)現(xiàn),除脂肪、

7、肌肉和腸外,AsNanos1蛋白在脾、心、卵巢、肝、腎、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦都表達(dá)。這與其mRNA在組織中的表達(dá)模式不一致。隨后,通過(guò)免疫熒光定位,發(fā)現(xiàn)AsNanos1在初級(jí)卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),并且隨著卵巢的發(fā)育,其分布在整個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明,對(duì)于Asnanos1的定位以及與其他因子的相互作用,可能存在著另外的一種機(jī)制。同時(shí),不同物種之間nanos1 mRNA表達(dá)特征具有保守性和差異性。

8、另外,AsNanos1可能在生殖細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起作用,同時(shí)也可以作為中華鱘初級(jí)卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞的標(biāo)記基因。
　　3. DAZ家族基因?yàn)樵谛韵偬禺惐磉_(dá),作為多種生物的生殖細(xì)胞標(biāo)記基因。在中華鱘中,克隆得到了dazl和boule的同源基因,即Asdazl和Asboule,并且發(fā)現(xiàn)Asboule至少存在10個(gè)亞型。Asdazl全長(zhǎng)cDNA序列為2337 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)闉?75 bp,編碼224個(gè)氨基酸,5’非編碼區(qū)為126 bp

9、,3’非編碼區(qū)為1536 bp;Asboule1全長(zhǎng)cDNA序列為2572 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)闉?062 bp,編碼353個(gè)氨基酸,5’非編碼區(qū)為157 bp,3’非編碼區(qū)為1353 bp。結(jié)構(gòu)域分析表明,AsDazl和AsBoule1都含有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,即RNA Recognition Motif和DAZ-repeat。同源性分析發(fā)現(xiàn),AsDazl與其他魚(yú)類(lèi)的氨基酸序列的一致性為60%左右,而與其他脊椎動(dòng)物 Dazl氨基酸的相似性

10、較低,只有40%左右;但是，AsBoule1與哺乳類(lèi)氨基酸序列的一致性為60%左右,而與其他脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的相似性很低,只有20%~30%左右,如青鳉(31%);另外,中華鱘AsDazl和AsBoule1的氨基酸序列一致性只有25%。不同亞型Asboule的分析和基因組擴(kuò)增結(jié)果表明,其在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中存在選擇性剪切,而且至少存在著兩個(gè)基因拷貝。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),Asdazl和Asboule1都只在性腺中表達(dá),而且Asdazl mR