突變型環(huán)酰亞胺水解酶的分子構(gòu)象與底物專一性.pdf

1、環(huán)酰亞胺水解酶(Cyclic imide hydrolase，CIH，EC.3.5.2.16)，是一類報道甚少的環(huán)酰胺酶類，在細(xì)菌、真菌與霉菌中分布廣泛。目前，有關(guān)CIH的報道主要有三例，分別來自于Blasterbacter sp.A17-4、Alcaligenes eatrophus 112R4和Pseudomonasputida YZ-26。其中，來源于Pseudomonas putida YZ-26的CIH293為我室專利。CIH

2、的亞基分子量約為35 kDa，其功能單位為四聚體，它的作用底物主要是簡單的環(huán)酰亞胺。CIH催化水解如琥珀酰亞胺等簡單環(huán)酰亞胺類底物開環(huán)生成相應(yīng)的酰胺酸，后者再在半酰胺酶的作用下生成相應(yīng)的二元羧酸，最后進(jìn)入TCA循環(huán)。 為研究環(huán)酰亞胺水解酶(CIH293)C-端區(qū)殘基對酶分子構(gòu)象及酶活性的影響，設(shè)計了C-末端缺失1～4個氨基酸殘基以及C-末端兩個Lys替代為兩個Glu或兩個Leu的突變酶，以野生型酶基因重組質(zhì)粒pE-cih293為

3、模板，在相應(yīng)引物存在下，通過PCR擴(kuò)增獲得突變的CIH基因片段，并將它們分別插入到pE32M載體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入工程菌Ecoli BL21(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行菌體酶活性分析，隨著C．末端缺失殘基的增多，酶活性喪失也越來越多，CIH292、CIH291喪失約20％的活性，CIH290喪失約85％的活性，CIH289喪失全部活性；而KK292,293EE保留約80％的活性，KK292,293LL喪失90％以上的活性。根據(jù)細(xì)

4、胞酶活性測定結(jié)果，選擇CIH291、CIH290、KK292,293EE、KK292,293LL進(jìn)行純化，經(jīng)Ni<'2+>-NTA agarose親和層析和Sephacryl S-200分子排阻層析獲得的突變酶達(dá)到了電泳純。 重組野生型酶與突變型酶酶活性測定、寡聚體形式、熒光光譜與CD譜分析表明，隨著C-末端缺失殘基的增多，酶活性喪失也越來越多，但酶分子的聚合狀態(tài)未發(fā)生變化，仍為同源四聚體；當(dāng)CIH的C-末端兩個Lys替代為兩個

5、Glu時，酶活性及分子結(jié)構(gòu)變化均不甚明顯，但當(dāng)替代為兩個Leu時，酶活性喪失殆盡，分子結(jié)構(gòu)變得松散而不再保持寡聚態(tài)。pH及熱穩(wěn)定性實驗也表明，酶的穩(wěn)定性與其分子的完整性密切相關(guān)。結(jié)果證實CIH的C-末端電荷殘基對該酶活性與分子狀態(tài)具有重要作用。 采用比色法與反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分析了重組野生型酶與突變型酶的底物專一性和動力學(xué)參數(shù)。通過對環(huán)酰亞胺類底物與其相應(yīng)產(chǎn)物的紫外掃描選擇了適宜監(jiān)測波長，流動相采用水和甲醇的混