嬰幼兒隱匿性乙型肝炎病毒感染的分子生物學(xué)特征分析.pdf

1、研究背景:
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是危害人類健康的重大傳染病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有20億人曾感染過(guò)HBV，其中慢性HBV感染者約為3.5億人，估計(jì)每年約有100萬(wàn)人死于因HBV感染所導(dǎo)致的相關(guān)疾病，如肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。我國(guó)是HBV感染的高流行地區(qū)，HBV攜帶者達(dá)9300萬(wàn)人，其中慢性乙肝患者達(dá)2500萬(wàn)，成為我國(guó)最

2、為重要的三大傳染病之一，也是引起HCC主要原因。近十年來(lái)，隱匿性乙型肝炎病毒感染(Occult hepatitis B virus infection，OBI)廣泛受到輸血醫(yī)學(xué)及臨床工作者的重視。定義為表面抗原檢測(cè)陰性，而血清或肝臟組織中HBV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性，實(shí)為乙型肝炎病毒(HBV)的一種潛伏性感染形式，而且是輸血、器官移植、血液透析傳播乙肝病毒的重要原因。我國(guó)慢性乙型肝炎感染主要是由圍生期母嬰傳播導(dǎo)致，由于新生兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育

3、成熟，容易導(dǎo)致免疫耐受而產(chǎn)生慢性感染，隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)展為肝硬化、肝癌的幾率也顯著升高。不但在輸血傳播疾病中OBI廣泛受到關(guān)注，自2008年以來(lái)越來(lái)越多的各國(guó)研究人員開始關(guān)注母嬰傳播OBI的分子免疫機(jī)制。OBI可發(fā)生于乙型肝炎表面抗體/乙型肝炎核心抗體(anti-HB s/anti-HBc)陽(yáng)性人群，也可發(fā)生于anti-HBs/anti-HBc陰性人群中，其檢測(cè)結(jié)果主要依賴于檢測(cè)乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B virus ant

4、igen，HBsAg)和HBV DNA試劑的靈敏度。研究表明，OBI形成最常見的原因是HBV基因變異尤其是S區(qū)及前S區(qū)變異，可影響HBV蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致HBsAg陰性，或者引起抗原表位構(gòu)相變化，影響抗原抗體反應(yīng)，導(dǎo)致試劑難以檢測(cè)。導(dǎo)致OBI的其他原因還包括HBV其他結(jié)構(gòu)區(qū)域變異，如X區(qū)變異，前C和C區(qū)變異等;另外，HBsAg分泌障礙導(dǎo)致大量HBsAg滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能分泌到胞外，從而導(dǎo)致HBsAg陰性的假象。再次，其他病毒感染的干擾，如H

5、BV與其他嗜肝性病毒或者HIV重疊感染，也可相互影響導(dǎo)致HBV復(fù)制受到限制呈現(xiàn)出HBsAg陰性的感染狀態(tài)。在Pre-s/s區(qū)的任一突變都可以導(dǎo)致改變HBsAg的抗原性并且會(huì)抑制anti-HBs的產(chǎn)生。該區(qū)域的第124到147氨基酸序列包含“a”決定簇和包含應(yīng)答anti-HBs顯性B細(xì)胞抗原簇。
　　研究目的:
　　本研究通過(guò)對(duì)HBsAg陽(yáng)性孕婦生產(chǎn)的嬰幼兒進(jìn)行跟蹤隨訪，以探究經(jīng)乙肝疫苗主被動(dòng)免疫和高效價(jià)乙肝免疫球蛋白(Hep

6、atitis B immunoglobulin，HBIG)被動(dòng)免疫以后，嬰幼兒乙型肝炎與隱匿性乙型肝炎感染的發(fā)生率及其分子免疫特征，進(jìn)而為乙肝或OBI的預(yù)防、臨床發(fā)生發(fā)展和個(gè)性化治療方案提供理論指導(dǎo)。
　　研究方法:
　　本研究采集乙肝表面抗原陽(yáng)性的母親及其分娩的嬰幼兒出生至少3個(gè)月以上后的血漿樣本，并在48個(gè)月內(nèi)進(jìn)行隨訪，第二次采集血液樣品。嬰幼兒樣本在南方醫(yī)院肝病中心使用美國(guó)雅培公司試劑盒采用化學(xué)發(fā)光法（CMIA）進(jìn)行H

7、BsAg定量（＜0.05IU/ml為陰性），anti-HBs的定量（＜10mIU/ml為陰性），HBeAg（S/CO值＜1為陰性）的檢測(cè)。在廈門大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗技術(shù)工程研究中心(NIDVD)采用EIA進(jìn)行全部樣品的anti-HBc的定量檢測(cè)，核酸標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自于英國(guó)NIBSC。應(yīng)用廣州達(dá)瑞公司乙型肝炎病毒e抗原時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒對(duì)母親樣本進(jìn)行HBeAg的定量。采用羅氏公司高純度核酸提取試劑盒提取血清HBV DNA核酸，根據(jù)文

8、獻(xiàn)，采用高靈敏度的巢式PCR和QPCR等的方法進(jìn)行HBV PreS/S、S區(qū)和BCP/PC區(qū)的擴(kuò)增，擴(kuò)增使用的Taq酶為Takara公司的rTaq和La-Taq酶。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)羅氏公司切膠純化回收試劑盒回收后送立菲公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序儀器為ABI3730。獲得序列經(jīng)Seqman和MEGA6序列分析軟件進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析。從Genbank基因數(shù)據(jù)庫(kù)選取我國(guó)B型，C型和D型HBV野毒株全基因序列作為參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。翻譯成蛋白質(zhì)

9、進(jìn)行突變分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹方法對(duì)所得樣本的基因型進(jìn)行分型。對(duì)于有疑問(wèn)的樣本進(jìn)行T載體克隆并分析鑒定。應(yīng)用高靈敏度的實(shí)時(shí)熒光定量(QPCR)方法對(duì)嬰幼兒和母親樣本分別進(jìn)行HBV DNA定量，標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自于英國(guó)NIBSC，靈敏度可達(dá)5IU/ml。
　　研究結(jié)果:
　　1.目標(biāo)人群:本研究共納入77位嬰幼兒及兒童，年齡分布3-96個(gè)月，共采集到92份樣本，其中62位只有1次隨訪抽血，15位有2次隨訪抽血。并收集到62位HBsAg陽(yáng)性母

10、親的68份血漿樣本，其中56位只有1次隨訪抽血，6位是進(jìn)行了2次隨訪抽血。同時(shí)還收集到6份HBsAg陽(yáng)性母親的臍帶血樣品。納入的母親平均年齡28歲。本研究中涉及到的新生兒乙肝疫苗接種率為100％，疫苗接種時(shí)間為產(chǎn)后24小時(shí)之內(nèi)，同時(shí)在與乙肝疫苗不同側(cè)臀部注射高效價(jià)乙肝免疫球蛋白(HBIG)進(jìn)行被動(dòng)免疫。
　　2.血清學(xué)指標(biāo):(1)對(duì)嬰幼兒樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3.9％(3/77) HBsAg陽(yáng)性患兒，其余均為HBsAg陰性;11.7％(9

11、/77)HBeAg陽(yáng)性;2.6％(2/77)HBsAg陰性/HBeAg陽(yáng)性/HBV DNA陰性;5.2％(4/77) HBsAg陰性/anti-HBs陰性/anti-HBc陰性。共有14.3％(11/77) anti-HBs水平大于1000mIU/ml，其中91％(10/11)都是在出生后6個(gè)月接種第三針乙肝疫苗以后檢測(cè)的，anti-HBs在小于6個(gè)月、6-12個(gè)月、大于12個(gè)月各年齡階段中位數(shù)分別為169.8(57.9-289.7)

12、mIU/ml,387.7(152.3-1301.2) mIU/ml,142.2(49.1-498.8) mIU/ml。共有80％(74/92)嬰幼兒樣本檢測(cè)anti-HBc陽(yáng)性，從6個(gè)月以后anti-HBc水平顯著下降，18個(gè)月以后普遍降至為陰性。(2)對(duì)母親樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，40.3％(25/62) HBeAg陽(yáng)性。(3)對(duì)6例臍帶血檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1例HBsAg為弱陽(yáng)性，有3例HBeAg陽(yáng)性，anti-HBc全部陽(yáng)性。
　　3.HBV

13、DNA檢測(cè):(1)在89份HBsAg陰性血漿樣本中（含59份初次采集樣品和15份第二次隨訪采集樣品），其中20份樣品擴(kuò)增出了BCP/PC片段，第2次隨訪樣本HBV DNA均為陰性，所有樣本Anti-HBs值均為陽(yáng)性(＞10mIU/ml)，同時(shí)有4份樣品的HBeAg值是陽(yáng)性(＞1 S/CO)。共發(fā)現(xiàn)87處突變，其中3例發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A雙突變，8例發(fā)現(xiàn)了G1896A，但是這8例均為HBeAg陰性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)G1752A，A18

14、46T，T1858C等處突變。(2) HBsAg陰性樣品中共有13份樣品擴(kuò)增出了S片段，同樣沒(méi)有第2次隨訪血液樣本，有8例同時(shí)擴(kuò)出了BCP/PC和S兩個(gè)片段。Anti-HBs值均為陽(yáng)性(＞10mIU/ml)，Anti-HBc也全部為陽(yáng)性。其中3例HBeAg陽(yáng)性。在S片段共發(fā)現(xiàn)8處氨基酸突變，分別為G45E、T139L、T47A、S53L、C76S、Q101R、T125M和P127T，未發(fā)現(xiàn)重要的V39A、P41H、E64K、G145R突

15、變。(3)92份樣本（上述89份樣品，再加3份初次隨訪HBsAg陽(yáng)性樣品）中HBsAg陰性經(jīng)QPCR檢測(cè)后HBV DNA陽(yáng)性(病毒載量，viral load，VL＞5 IU/ml)的樣品共有13例，Anti-HBs也均為陽(yáng)性(＞10 mIU/ml)，且HBeAg都為陰性(＜1 S/CO)，有4例是BCP/PC，S和VL均為陽(yáng)性，其中BCP/PC或者S陽(yáng)性和VL陽(yáng)性的有5例。(4)6例臍帶血中有1例巢式PCR擴(kuò)增S片段為陽(yáng)性。(4)S基因

16、序列母嬰比對(duì):對(duì)HBsAg陽(yáng)性的3例嬰兒樣品進(jìn)行分析，樣品B75的S片段的與其母親的比較有4個(gè)堿基不一致，分別是357位，381位，480位，636位，導(dǎo)致4個(gè)氨基酸變異，分別為T68I，Y76C，Q109L，Y161F。而B74和B76與其母親的HBV S片段氨基酸完全一致。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)樹分析，13例HBV DNA S片段陽(yáng)性樣品中B基因型10例，C基因型2例，D基因型1例。與12位母親獲得相應(yīng)的HBV S序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有6對(duì)母嬰序列高

17、度一致并且基因型相同，但是另外6對(duì)母嬰HBV S序列與基因型不同。
　　研究結(jié)論:
　　對(duì)廣州市南方醫(yī)院（三甲級(jí)）HBV母嬰傳播調(diào)查顯示，母親為乙肝表面抗原陽(yáng)性的新生兒出現(xiàn)HBsAg陽(yáng)性的比率為3.9％(3/77)，出現(xiàn)HBeAg陽(yáng)性的比率為11.7％(9/77)，出現(xiàn)HBV DNA陽(yáng)性的比率為36.4％(28/77)。由于第2次48個(gè)月內(nèi)隨訪采集的血液樣本中未發(fā)現(xiàn)HBV DNA陽(yáng)性樣品，因此本研究調(diào)查中所有的HBsAg陰性