攜HSV-TK基因的納米靶向陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡增效治療HIFU不全消融后殘余肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)肝癌的發(fā)病及致死率位居全球之首。目前肝癌的治療方式有多種選擇，手術(shù)切除仍是早期肝癌的主要治療方式，但術(shù)后存在較高的復(fù)發(fā)率，且多數(shù)患者就診時(shí)已為中晚期或終末期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)。目前我國(guó)對(duì)喪失手術(shù)機(jī)會(huì)的中晚期肝癌的治療以射頻治療及經(jīng)肝動(dòng)脈介入栓塞化療為主要方式，但其存在較多嚴(yán)重并發(fā)癥且給患者帶來(lái)較大痛苦。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）作為新的治療手段已被廣泛應(yīng)用于臨床，在眾多腫

2、瘤或非腫瘤性疾病的治療中取得較好的效果。HIFU治療的原理主要是通過(guò)超聲波的熱效應(yīng)來(lái)殺滅病灶，但在臨床治療腫瘤時(shí)，由于腫瘤大多位于深部組織或器官，超聲波穿透組織時(shí)不可避免的產(chǎn)生聲能衰減，同時(shí)腫瘤區(qū)域的血供豐富，能量會(huì)隨血液快速流動(dòng)而衰減，這些因素都限制了HIFU治療的徹底性，降低了HIFU療效，從而導(dǎo)致了腫瘤組織不能完全被殺滅，增加了腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)研究表明腫瘤一旦復(fù)發(fā)，其侵襲能力較原發(fā)時(shí)明顯增加。因此如何提高HIFU治療效果，降低

3、腫瘤的殘留或復(fù)發(fā)成為目前研究熱點(diǎn)。隨著研究的進(jìn)展，腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展與基因突變或缺失相關(guān)，因此基因治療被廣大學(xué)者認(rèn)為是最具潛力的治療方式。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療中最有成效的方案之一，HSV-TK/GCV系統(tǒng)是自殺基因的一種，HSV-TK本身不具備殺傷功能，其轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后可將無(wú)毒的GCV轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性物質(zhì)進(jìn)行殺傷。但如何將HSV-TK高效、安全、無(wú)創(chuàng)、無(wú)毒的轉(zhuǎn)染進(jìn)入組織細(xì)胞成為限制其發(fā)展的瓶頸。
　　近年來(lái)，靶向超聲微泡被廣

4、泛應(yīng)用于基因的攜載，載基因微泡注入體內(nèi)后通過(guò)其表面靶向性配體、抗體與腫瘤組織受體特異性結(jié)合，從而在靶區(qū)域聚集，利用一定強(qiáng)度超聲體表輻照使微泡破裂，從而釋放攜帶目的基因，同時(shí)微泡破裂產(chǎn)生的空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)，可促進(jìn)細(xì)胞膜通透性增加，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染。
　　因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們制備了納米級(jí)陽(yáng)離子微泡，并將肝癌特異性表達(dá)的GPC3抗體進(jìn)行連接構(gòu)建靶向陽(yáng)離子微泡，然后再將HSV-TK質(zhì)粒與靶向陽(yáng)離子微泡連接，構(gòu)建納米攜基因靶向陽(yáng)離子微泡并檢

5、測(cè)其物理性能，通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，探討其靶向能力及HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)腫瘤的治療作用。本課題包括以下三部分：
　　第一部分.攜基因靶向超聲微泡的制備
　　第一節(jié):納米微泡的制備及鑒定
　　目的:構(gòu)建不同類型超聲微泡用于攜帶目的基因。
　　方法:通過(guò)機(jī)械震蕩法來(lái)構(gòu)建不同的脂質(zhì)微泡，其中陽(yáng)離子微泡在成膜材料中加入DC-膽固醇（DC-cholesterol）使微泡表面帶正電荷，以此來(lái)構(gòu)建陽(yáng)離子微泡（CMB），在光

6、鏡下觀察各種微泡的基本形態(tài)及均一性，檢測(cè)各種微泡的表面電位和粒徑。
　　結(jié)果:各種微泡構(gòu)建成功，光鏡下觀察兩種微泡分布均勻，粒徑大小均一，普通微泡表面電荷為-2.38±0.56mV，呈微弱負(fù)電荷，陽(yáng)離子微泡的表面電位為26.44±2.13mV，普通微泡的粒徑為512.57±25.18nm，陽(yáng)離子微泡的粒徑為502.63±21.26nm。
　　結(jié)論:兩種微泡間相互比較，電位具有顯著性差異（p＜0.01），粒徑間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義（p＞0.05）。
　　第二節(jié):靶向微泡的構(gòu)建及其性能檢測(cè)
　　目的:將GPC3抗體及HSV-TK質(zhì)粒與微泡連接，構(gòu)建攜基因靶向微泡。
　　方法:將制備好的陽(yáng)離子微泡通過(guò)“生物素-親和素”法與靶向抗體GPC3單抗進(jìn)行連接，同時(shí)將陽(yáng)離子微泡與同型對(duì)照抗體連接；構(gòu)建成功的普通微泡、陽(yáng)離子微泡、靶向陽(yáng)離子微泡（5×108個(gè)）與質(zhì)粒（HSV-TK）共孵育，利用靜電吸附原理使二者充分結(jié)合，然后進(jìn)行洗滌、離心，通過(guò)對(duì)未結(jié)合的

8、質(zhì)粒的量進(jìn)行測(cè)定來(lái)檢測(cè)不同類型微泡攜帶質(zhì)粒能力，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)質(zhì)粒及抗體與微泡的連接情況。
　　結(jié)果:普通攜基因微泡、陽(yáng)離子攜基因微泡、靶向陽(yáng)離子攜基因微泡及陽(yáng)離子對(duì)照抗體微泡成功構(gòu)建，激光共聚焦下連接成功的微泡大小均一，分散度較好，激光共聚焦顯微鏡下GPC3抗體與微泡連接后呈現(xiàn)綠色熒光，HSV-TK質(zhì)粒與微泡連接后呈現(xiàn)紅色熒光，二者原位重疊后呈現(xiàn)黃色熒光，表明成功構(gòu)建靶向攜基因微泡。普通微泡、陽(yáng)離子微泡和陽(yáng)離子靶向微泡攜帶

9、HSV-TK質(zhì)粒的能力分別為0.36±0.03μg，17.91±1.15μg和17.26±2.01μg，兩組陽(yáng)離子微泡之間攜帶質(zhì)粒的能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），陽(yáng)離子微泡與普通微泡之間比較，差異具有顯著性（p＜0.01）。
　　結(jié)論:通過(guò)“生物素-親和素”系統(tǒng)可以將納米微泡、HSV-TK質(zhì)粒及GPC3抗體成功連接，成功構(gòu)建了納米級(jí)靶向攜基因微泡；陽(yáng)離子微泡攜基因能力明顯大于普通微泡，陽(yáng)離子微泡連接抗體后并不影響其攜載能力。<

10、br>　　第二部分.攜HSV-TK基因的不同類型微泡尋靶和在超聲作用下轉(zhuǎn)染HEPG-2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　第一節(jié):攜基因靶向微泡的體外、體內(nèi)尋靶能力檢測(cè)
　　目的:檢測(cè)普通微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡體外、體內(nèi)靶向?qū)ふ襀epG-2細(xì)胞的能力。
　　方法:
　?。?）利用免疫組化法證實(shí)HepG-2細(xì)胞膜存在GPC3抗原表達(dá)；
　?。?）利用自行設(shè)計(jì)的玻板進(jìn)行HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁，然后將細(xì)胞已貼

11、壁的玻板翻轉(zhuǎn)并與微泡充分孵育后，再將玻板翻轉(zhuǎn)，倒置顯微鏡下觀察HepG-2細(xì)胞與微泡結(jié)合數(shù)，檢測(cè)不同類型微泡的體外尋靶能力；
　　（3）裸鼠皮下注射肝癌HepG-2細(xì)胞，建立裸鼠肝癌種植瘤模型,免疫組化法證實(shí)GPC3表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面。不同類型微泡經(jīng)裸鼠尾靜脈注射，通過(guò)超聲腫瘤成像，檢測(cè)其體內(nèi)靶向腫瘤細(xì)胞能力。兩部分實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照抗體陽(yáng)離子微泡作為陽(yáng)離子靶向微泡的對(duì)照而納入實(shí)驗(yàn)分組中，競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)被用于證實(shí)靶向陽(yáng)離子微泡與靶細(xì)胞的特

12、異性結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　（1）免疫組化法證實(shí)HepG-2細(xì)胞表面存在GPC3抗原表達(dá)；
　?。?）尋靶試驗(yàn)，除普通微泡外，陽(yáng)離子微泡、靶向陽(yáng)離子微泡、陽(yáng)離子對(duì)照抗體微泡均可與表達(dá)GPC3抗原的HepG-2細(xì)胞結(jié)合，而陽(yáng)離子靶向微泡與HepG-2細(xì)胞靶向結(jié)合數(shù)量最高（P＜0.01）；率先加入GPC3抗體孵育后，靶向陽(yáng)離子微泡與HepG-2細(xì)胞結(jié)合數(shù)量明顯降低（P＜0.01）；而細(xì)胞與同型對(duì)照抗體共孵育后，靶向陽(yáng)離子微

13、泡與HepG-2細(xì)胞結(jié)合數(shù)量沒(méi)有明顯影響（P＞0.05）；
　　（3）體內(nèi)試驗(yàn)中，超聲證實(shí)：除靶向陽(yáng)離子微泡外，普通微泡、陽(yáng)離子微泡及陽(yáng)離子對(duì)照抗體微泡均不能靶向結(jié)合表達(dá)GPC3抗體的腫瘤細(xì)胞；在超聲顯像的造影模式和傳統(tǒng)灰階模式下，與對(duì)照組相比，經(jīng)普通微泡、陽(yáng)離子微泡與靶向陽(yáng)離子微泡注射后，種植瘤內(nèi)均可見(jiàn)回聲增強(qiáng)；且陽(yáng)離子微泡組與靶向陽(yáng)離子微泡組比普通微泡組回聲更強(qiáng)，其中靶向陽(yáng)離子微泡組回聲最強(qiáng)。體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)：通過(guò)裸鼠尾靜脈注

14、射GPC3抗體后，靶向陽(yáng)離子微泡與腫瘤細(xì)胞靶向結(jié)合數(shù)量顯著降低（P＜0.001）。
　　結(jié)論:
　?。?）陽(yáng)離子微泡、靶向陽(yáng)離子微泡及陽(yáng)離子對(duì)照抗體微泡均可與表達(dá)GPC3抗原的HepG-2細(xì)胞結(jié)合，但只有靶向陽(yáng)離子微泡能與HepG-2細(xì)胞靶向結(jié)合，而陽(yáng)離子微泡及陽(yáng)離子對(duì)照抗體微泡與HepG-2細(xì)胞結(jié)合是非特異性結(jié)合，這種結(jié)合方式的優(yōu)勢(shì)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不復(fù)存在；
　?。?）超聲顯像也證實(shí)靶向陽(yáng)離子微泡體內(nèi)較好的尋靶效果，充分

15、證實(shí)了靶向陽(yáng)離子微泡體內(nèi)、體外均具有較好的靶向能力。
　　第二節(jié):超聲作用下攜HSV-TK基因的不同類型微泡轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討在超聲作用下普通微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，以及轉(zhuǎn)染后HSV-TK/GCV對(duì)細(xì)胞增殖抑制、腫瘤細(xì)胞侵襲的影響。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、普通微泡組、陽(yáng)離子微泡組、靶向陽(yáng)離子組四組，將不同類型微泡連接HSV-TK質(zhì)粒后，超聲（1M

16、Hz,1W/cm2, and50％duty cycle(DC),30seconds）作用下轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，qPCR及Western分別檢測(cè)TK、VEGF、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)情況；通過(guò)體外HepG-2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　?。?）轉(zhuǎn)染24小時(shí)后各組的轉(zhuǎn)染效率分別為0.31±0.05%，2.67±0.27%，21.38±2.04%，

17、34.39±2.93%，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；
　?。?）轉(zhuǎn)染后24小時(shí)行 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，分別為8.25±0.93%，10.01±0.85%，42.36±3.87%，58.17±5.08%，靶向陽(yáng)離子微泡組細(xì)胞增殖活性降低，組間比較差異亦具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；
　?。?）qPCR和Western檢測(cè)：在陽(yáng)離子微泡和靶向陽(yáng)離子微泡組，TK和Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)增加，而V

18、EGF mRNA及蛋白表達(dá)下降，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　?。?）在腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，各組遷移腫瘤細(xì)胞數(shù)目分別為：61.25±4.29、66.53±5.25、63.86±4.98、34.59±2.94、24.91±2.25，各組間比較差異具有顯著性（P＜0.01）。
　　結(jié)論:陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡組與對(duì)照組及普通微泡組比較，轉(zhuǎn)染效率明顯增高，其中靶向陽(yáng)離子微泡組具有更高的轉(zhuǎn)染率及其相應(yīng)的生物學(xué)

19、效應(yīng)，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤細(xì)胞的侵襲。
　　第三部分.超聲作用下攜HSV-TK基因的不同類型微泡轉(zhuǎn)染治療HIFU不全消融后殘余肝癌的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討普通微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡攜HSV-TK質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染治療HIFU不全消融HepG-2種植瘤效果，觀察各組微泡對(duì)殘癌組織生長(zhǎng)的影響及治療作用。
　　方法:
　?。?）裸鼠左后肢皮下注射HepG-2細(xì)胞懸液建立種植瘤模型，造模后14天，

20、裸鼠種植瘤模型建立成功，給予HIFU治療，進(jìn)行不全性消融，建立殘癌模型；
　?。?）隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組（經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水）、普通微泡組（經(jīng)尾靜脈注射普通微泡）、陽(yáng)離子微泡組（經(jīng)尾靜脈注射陽(yáng)離子微泡）及靶向陽(yáng)離子微泡組（經(jīng)尾靜脈注射靶向陽(yáng)離子微泡），每組微泡均已與HSV-TK質(zhì)粒連接；
　?。?）轉(zhuǎn)染后行活體成像掃描，并應(yīng)用圖像分析軟件評(píng)價(jià)尋靶效果；
　　（4）尋靶成功后，普通微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡

21、各組在超聲（1MHz,2W/cm2, and50%DC,30seconds）作用下轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后予以GCV腹腔注射；
　?。?）用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中TK、PCNA、CD31及VEGF的表達(dá)；并通過(guò)CD31的表達(dá)計(jì)算腫瘤細(xì)胞微血管形成情況，q-PCR檢測(cè)TK、VEGF和caspase3mRNA表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡；記錄荷瘤裸鼠生存時(shí)間。
　　結(jié)果:
　?。?）HE染色證實(shí)癌細(xì)胞殘留，HIFU不全

22、消融模型成功構(gòu)建，微泡注入后行活體成像見(jiàn)殘癌組織出現(xiàn)綠色熒光，HSV-TK質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入組織細(xì)胞；
　?。?）免疫組化及q-PCR結(jié)果顯示除對(duì)照組外，各組均有TK蛋白表達(dá)，且陽(yáng)離子靶向微泡組表達(dá)水平最高，再次證實(shí)HSV-TK基因成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)；
　?。?）免疫組化及TUNEL結(jié)果顯示靶向陽(yáng)離子微泡組腫瘤增殖明顯受到抑制（P<0.01）、凋亡指數(shù)明顯增高（P<0.01），血管生成受到明顯抑制（P<0.05），生存時(shí)