微泡造影劑聯(lián)合超聲輻照介導(dǎo)HSV-TK基因靶向血管治療小鼠肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究皮下接種法建立小鼠肝癌移植瘤動(dòng)物模型，通過(guò)構(gòu)建由KDR啟動(dòng)子調(diào)控的、微泡造影劑協(xié)同超聲輻照介導(dǎo)的、單純皰疹病毒胸苷激酶(HSK-tk)基因系統(tǒng)，探討了自殺基因靶向肝癌血管治療肝癌的可行性和有效性，為建立一種新型、安全、高效的基因轉(zhuǎn)染模式奠定初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分小鼠皮下肝癌移植瘤模型的建立與鑒定建立與鑒定C57BL/6J小鼠皮下肝癌移植瘤模型。 常規(guī)體外培養(yǎng)小鼠Hepa1-6肝癌細(xì)胞，每只小鼠右側(cè)腰脅部皮下接種

2、0.1mLHepa1-6細(xì)胞懸液(2×10<'6>/mL)，定期測(cè)量腫瘤的大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。超聲檢測(cè)腫瘤的二維及彩色超聲所見(jiàn)，篩選基因治療理想的動(dòng)物模型。剝?nèi)∧[瘤行常規(guī)及病理學(xué)檢查。 小鼠肝癌皮下移植瘤成功率為85﹪(17/20)；超聲所見(jiàn)瘤體回聲類型可表現(xiàn)低、等、混合回聲；瘤體最大徑線小于1.5cm者內(nèi)無(wú)液化表現(xiàn)，大于1.5cm者瘤體內(nèi)有不規(guī)則液區(qū)。病理證實(shí)為肝細(xì)胞性肝癌。 通過(guò)皮下接種法建立的小鼠肝癌具有操作簡(jiǎn)

3、便、模型穩(wěn)定，成功率高等特點(diǎn)，超聲監(jiān)測(cè)可做為此模型監(jiān)測(cè)和篩選的重要手段。 第二部分微泡造影劑聯(lián)合超聲輻照對(duì)小鼠肝癌微血管通透性的影響。 目的：觀測(cè)微泡造影劑聯(lián)合超聲輻照對(duì)肝癌微血管通透性的影響。 方法：建立小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型30只，隨機(jī)分為3組,各組分別經(jīng)尾靜脈注入FD500(0.5mL)、FD500(0.5mL)、FD500(0.5mL)+SonoVue(0.1mL)，后2組分別予以脈沖

4、性超聲輻照(1MHz，3w/cm<'2>，10min)。熒光顯微鏡下計(jì)測(cè)大分子熒光素物質(zhì)FD500穿透血管內(nèi)皮細(xì)胞膜或微血管壁顯影情況。HE染色行腫瘤病理學(xué)檢查。結(jié)果超聲輻照組和SonoVue聯(lián)合超聲輻照組陽(yáng)性顯影的微血管計(jì)數(shù)分別為12.82±1.19和20.65±1.23，p<0.05，對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性計(jì)數(shù)。HE染色各組標(biāo)本均未見(jiàn)明顯的壞死及炎性浸潤(rùn)。 結(jié)論：超聲輻照可提高微血管壁通透性，SonoVue可增強(qiáng)該效應(yīng)。 第三

5、部分微泡造影劑聯(lián)合超聲輻照介導(dǎo)綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝癌的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：研究不同物理參數(shù)對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響，確定最佳的劑量-效應(yīng)關(guān)系。 方法：按第一部分方法建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型。將微泡造影劑SonoVue和pEGFP混合，4℃靜上30min，按不同的轉(zhuǎn)染條件依次分組。 1.荷瘤鼠16只，尾靜脈注入60μl SonoVue和60μg pEGFP。輻照頻率1MHz，輻照聲強(qiáng)3w/cm<'2>。根據(jù)不同輻

6、照時(shí)間隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(無(wú)輻照)、1min、5min、10min。 2.荷瘤鼠16只，尾靜脈注入60μl Son0Vue和60μg pEGFP。輻照頻率1MHz，輻照時(shí)間5min。根據(jù)不同的輻照聲強(qiáng)隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(無(wú)輻照)、1w/cm<'2>、2w/cm<'2>、3w/cm<'2>。 3.荷瘤鼠16只，尾靜脈注入超聲造影劑和60μg pEGFP。輻照頻率1MHz，輻照時(shí)間5min，輻照聲強(qiáng)2w/cm<'2>。根

7、據(jù)超聲SonoVue不同劑量分為4組：對(duì)照組(無(wú)造影劑)、30μl組、60μl組、90μl組。 4.荷瘤鼠16只，分為4組：A組，pEGFP(60μg)組；B組，pEGFP(60μg)+SonoVue(60μl)組；C組，pEGFP(60μg)+超聲輻照組；D組pEGFP(60μg)+SonoVue(60μl)+超聲輻照組。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束7天后處死小鼠，流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)鼠腫瘤組織中pEGFP表達(dá)。 結(jié)果：

8、 1.對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)無(wú)EGFP的表達(dá)，輻照時(shí)間5min(23.22﹪±1.91﹪)、10min(24.41﹪±1.51﹪)EGFP轉(zhuǎn)染率與1min(16.04﹪±1.61﹪)組比較差異有顯著性(P<0.05)，與對(duì)照組(2.73﹪±0.42﹪)比較差異有顯著性(P<0.01)，但5min組與10min組EGFP轉(zhuǎn)染率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 2.對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)無(wú)EGFP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)2W/cm<'2>組(

9、21.02﹪±1.45﹪)和3w/cm<'2>組(23.22﹪±1.91﹪)與1w/cm<'2>組(16.33﹪±1.59﹪)相比，EGFP轉(zhuǎn)染率有顯著性差異(p<0.05)，與對(duì)照組(2.73﹪±0.42﹪)比較差異有顯著性(p<0.01)，而2w/cm<'2>組和3w/cm<'2>組之間EGFP的轉(zhuǎn)染率差異無(wú)顯著性(p>0.05)。 3.30μSonoVue組(15.57﹪±1.45﹪)與對(duì)照組(13.01﹪±1.21﹪)(

10、僅超聲輻照無(wú)SonoVue)比較，腫瘤組織內(nèi)EGFP轉(zhuǎn)染率無(wú)顯著性差異(p>0.05)。60μ組(21.02﹪±1.45﹪)、90μ組(22.97﹪±1.87﹪)與30μ組、對(duì)照組比較EGFP的轉(zhuǎn)染率均有顯著差異(p<0.05)，而60μ組和90μ組間EGFP的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示D組腫瘤組織內(nèi)EGFP轉(zhuǎn)染率(20.87﹪±2.21﹪)與C組(12.77﹪±1.69﹪)比較差異有顯著性(p<0.05)

11、；D組、C組與A組EGFP轉(zhuǎn)染率(2.14﹪±0.51﹪)比較差異有顯著性(p<0.01)。A組與B組(2.73﹪±0.42﹪)EGFP轉(zhuǎn)染率比較差異無(wú)顯著性(p<0.05)。 結(jié)論：不同的輻照條件和造影劑量對(duì)基因轉(zhuǎn)染率有明顯影響。結(jié)果表明1MHz、2W/cm<'2>、5min、60μSonoVue是本研究最適宜的物理參數(shù)。SonoVue本身不介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，但可明顯增強(qiáng)超聲輻照介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染。 第四部分：微泡造影劑聯(lián)合超

12、聲介導(dǎo)HSV-TK基因系統(tǒng)靶向血管治療小鼠肝癌。 目的：評(píng)估微泡造影劑SonoVue聯(lián)合超聲輻照介導(dǎo)KDR啟動(dòng)子-單純皰疹病毒胸苷激酶基(HSV-tk)系統(tǒng)(pKDR-tk)結(jié)合更昔洛韋(GCV)靶向血管治療小鼠肝癌的有效性. 方法：小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。分別經(jīng)尾靜脈注入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、pKDR-tk(60gg)、pKDR-tk(60μg)+Sonovue(

13、60μl)、pKDR-tk(60μg)+SonoVue(60μl)，后兩組分別給予1MHz，2W/cm<'2>，5min的超聲輻照，第二天重復(fù)治療一次。24小時(shí)后各組小鼠腹腔內(nèi)注射GCV100mg/kg/d，連續(xù)10天，監(jiān)測(cè)腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率，觀測(cè)小鼠生存時(shí)間。RT-PCR分析腫瘤組織內(nèi)TK mRNA的表達(dá)?？笴D34免疫組化檢測(cè)腫瘤組織微血管密度(MVD)。TUNEL染色檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1.抑瘤率

14、在PBS組(A組)、pKDR-tk/GCV組(B組)、pKDR-tk+US/GCV組(C組)、pKDR-tk+US+SonoVue/GCV組(D組)分別為0﹪、3.6﹪±2.7﹪、21.4﹪±2.9﹪和40.7﹪±4.5﹪統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，D組與BN，D組與C組，C組與B組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。 2.各組小鼠平均生存時(shí)間分別為54.5±6.4d、56.2±5.1d、82±7.9d、98d±7.7d。D組與B組(p<0.0

15、1)，C組與B組(p<0.05)間生存時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B組與A組(P>0.05)間生存時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。D組生存時(shí)間雖長(zhǎng)于C組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 3.半定量RT-PCR分析腫瘤組織內(nèi)TK mRNA的表達(dá)：C組、D組腫瘤組織內(nèi)均有TKmRNA的表達(dá)；B組極低水平表達(dá)TK mRNA：A組無(wú)TK mRNA表達(dá)。 4.各組腫瘤微血管密度分別為：A組，48.8±5.1；B組，44.2±6.4；cN，27.4±

16、3.2：D組，12.3±1.4。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，B組與A組，p>0.05：C組與A組，p<0.05；D組與A組，p<0.01；DN與C組，p<0.05。 5.TUNEL染色檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡：與A組、B組比較，鏡下C組、D組中可見(jiàn)著色的凋亡細(xì)胞顯著增多，D組更為明顯。凋亡指數(shù)分別是：A組，14﹪±1.2﹪；B組，17﹪±1.8﹪；C組，25﹪±3.6﹪：D組，36﹪±3.8﹪(D組與C組，p<0.05；D組與A組，p<0.01