載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針靶向識別并殺滅HIFU治療肝癌后殘留病灶的實驗研究.pdf

1、肝癌是一個全球性健康問題，全世界每年因肝癌造成66萬2千人死亡，而我國占一半。肝切除和肝移植被認為是治療肝癌最佳方案，然而由于肝癌的早期癥狀和體征不明顯，早期診斷困難，多數(shù)患者臨床就診時屬于中晚期，已經(jīng)遠處轉(zhuǎn)移，大部分不能手術切除。
　　高強度聚焦超聲(HIFU)是無創(chuàng)性治療腫瘤的新方法，其機制主要是應用超聲波可聚焦和穿透性，短時間內(nèi)使靶區(qū)組織溫度達到65～100℃，使靶組織造成凝固性壞死，HIFU是治療中晚期肝癌安全、有效的方法

2、。但HIFU治療肝癌也存在一些缺陷:a.肝臟腫瘤由于肋骨遮擋，導致治療效率的降低;b中晚期肝癌，血供豐富，熱沉積效率低，聚焦點能量低，療效差;c.由于肝臟隨呼吸運動，HIFU定位不準確，可能出現(xiàn)治療盲區(qū)，造成殘癌的存在。由于以上原因，導致HIFU治療肝癌后易復發(fā)可能，為了解決以上問題，可聯(lián)合基因治療，力求徹底殺滅殘余肝癌細胞，彌補HIFU治療的不足，提高HIFU治療中晚期肝癌的療效。
　　單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韋(HSV

3、1-TK/GCV)自殺基因系統(tǒng)，是眾多腫瘤基因治療效果明顯、應用最廣泛、最成熟、最為有效的基因治療方法之一。自殺基因系統(tǒng)的原理:通過胸甘激酶的表達，磷酸化前藥更昔洛韋，阻止肝癌細胞的DNA合成，從而起殺滅肝癌細胞的作用。自殺基因系統(tǒng)直接殺傷作用及旁觀者效應作用顯著。
　　最近出現(xiàn)的一種超聲波靶向爆破攜基因的微泡技術(UTMD)，即當攜基因的微泡造影劑經(jīng)靜脈注射進入腫瘤組織時，經(jīng)超聲聲像圖確定其到達靶組織后，通過低頻超聲波擊碎攜基因

4、的微泡造影劑，產(chǎn)生的空化效應及機械效應，使外源性基因進入腫瘤組織，在低頻的超聲輻照條件下，超聲既可提高靶基因的轉(zhuǎn)染率，又不破壞轉(zhuǎn)染基因，實現(xiàn)基因治療的靶向性和準確性。
　　前期試驗在國家自然科學基金的資助下（高強度聚焦超聲聯(lián)合超聲微泡包裹HSV-TK自殺基因靶向治療肝癌的實驗研究NO.30872977)，我們證明了在小鼠移植瘤模型中，通過超聲波靶向爆破攜自殺基因的微泡釋放，明顯增加自殺基因轉(zhuǎn)染率及靶向性。
　　但我們的課題仍

5、有些不足之處:a.由于脂質(zhì)微泡不能通過血管內(nèi)皮間隙，因而脂質(zhì)微泡并未真正意義上進入腫瘤細胞，僅在腫瘤血管周圍聚集，降低了治療效果;b.攜基因的微泡在基因治療中無主動靶向性，僅有相對靶向性，其原理為:脂質(zhì)微泡通過腫瘤區(qū)動脈壓與周圍動脈壓壓力差，隨血液聚集到腫瘤區(qū)域，因此僅具有相對靶向性，不能主動識別腫瘤組織。以上缺點導致基因治療效果不佳，如何提高基因治療的主動靶向性，是基因治療的熱點問題。
　　超聲分子探針即靶向超聲微泡（球）造影劑

6、，是將能與靶組織上相應的受體結(jié)合的特異性配體耦聯(lián)到微泡表面，使其能主動識別靶組織，達到分子水平的特異性增強顯影。
　　隨著分子生物學與納米技術發(fā)展，納米級造影劑以其穿透力強、分子小的突出特性，有望彌補脂質(zhì)微泡不能通過血管內(nèi)皮間隙的不足，成為基因的新型載體。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)，是存在于肝細胞性肝癌細胞膜表面的硫酸乙酰肝素多糖蛋白(HSPC)，參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。AFP定位于肝細胞胞漿中，在循環(huán)中可

7、被抗體中和，不適合為抗體識別位點，GPC3是存在于細胞膜表面，可成為抗體識別部位。因此，我們選用GPC3單抗與納米級超聲造影劑結(jié)合，構(gòu)建具有主動靶向性的納米級超聲分子探針，有望解決基因治療時低轉(zhuǎn)染率、靶向性差等諸多問題。
　　本項目旨在主動投遞靶向造影劑即超聲分子探針于殘癌組織內(nèi)并在殘留肝癌組織中特異性表達，利用超聲分子主動靶向識別殘癌組織，進而使自殺基因利用直接殺傷和旁殺作用殺滅殘癌組織，力圖在HIFU和聯(lián)合基因靶向治療肝癌方面

8、取得新的進展。
　　本課題研究內(nèi)容主要包括以下三個部分:
　　第一部分載HSV-TK自殺基因的肝癌特異性納米級超聲分子探針合成
　　目的:制備載HSV1-TK自殺基因的肝癌特異性納米級超聲分子探針.
　　方法:生物素-親和素構(gòu)建GPC3單抗與納米級超聲造影劑結(jié)合，應用超聲圖像定量分析儀(DFY軟件分析系統(tǒng))分析超聲圖像的視頻強度改變，并描繪時間一峰值曲線，Zeta電位儀測試分析出載HSV1-TK自殺基因的肝癌特異

9、性納米級超聲分子探針平均粒徑、電位、濃度。
　　結(jié)果:超聲聲像圖可見，注入超聲分子探針（主動靶向造影劑）造影劑呈向心性強化逐漸聚集到腫瘤中心，直至腫瘤全部強化，與普通造影劑比較，超聲分子探針造影峰值((VI))更高，聲強更強，達峰時間縮短，持續(xù)時間更長。Zeta電位儀測試分析出載HSV-TK自殺基因的肝癌特異性納米級超聲分子探針，其平均粒徑、電位、濃度符合納米級超聲分子探針要求。
　　結(jié)論:成功制備載HSV1-TK自殺基因的

10、肝癌特異性納米級超聲分子探針，能夠在裸鼠殘癌模型中增強顯像，是一種理想的超聲分子探針。
　　第二部分低頻超聲輻照載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針靶向治療HIFU消融后裸鼠殘留肝癌實驗研究
　　目的:觀察低頻超聲輻照載HSV1-TK基因納米超聲分子探針在HIFU消融后裸鼠殘留肝癌組織中的表達情況及結(jié)合前藥更昔洛韋(GCV)對HIFU消融后裸鼠殘留肝癌的殺傷效果。
　　方法:取荷瘤裸鼠肝癌60只，HIFU治療儀（重慶

11、海扶技術有限公司研制）對裸鼠肝癌消融80％后，成功建立裸鼠殘留肝癌模型。隨即分成六組，每組10只，A組:HIFU聯(lián)合超聲輻照載基因納米級超聲分子探針組（主動靶向組）（HIFU+US+HSV1-T K+NB+G PC3）;B組: HIFU聯(lián)合超聲輻照基因納泡組（被動靶向組）(HIFU+US+HSV1-TK+NB):C組:HIFU聯(lián)合載基因超聲分子探針組(HIFU+HSV1-TK+NB+GPC3);D組:HIFU聯(lián)合超聲輻照基因組(HIFU

12、+US+HSV1-TK);E組:HIFU聯(lián)合超聲輻照超聲分子探針組(HIFU+US+NB+GPC3);F組:HIFU治療組（空白對照組）。分別經(jīng)殘癌裸鼠尾靜脈注入相同濃度的: HSV1-TK+NB+GPC3，HSV1-TK+NB, HSV1-TK+NB+GPC3, HSV1-TK, GPC3, PBS,A、B、D、E組分別給予超聲輻照，Real-time PCR檢測TK mRNA表達情況，Western-blot及免疫組化檢測TK蛋白的

13、表達情況，用TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡情況，繪制抑瘤曲線。
　　結(jié)果:免疫組化及Real-time PCR及Western-blot及調(diào)亡指數(shù)及抑瘤率均顯示A組（主動靶向組）TK的表達量明顯高于被動靶向組和其他各組(P＜0.05)，且能明顯改善殘癌裸鼠的生存時間。
　　結(jié)論:低頻超聲輻照載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針，主動靶向投遞HSV1-TK自殺基因于殘癌組織內(nèi)并在殘留肝癌組織中特異性表達，提高HSV1-TK自殺

14、基因的轉(zhuǎn)染效率，增強了自殺基因?qū)β闶髿埌┑臍Ч?br>　　第三部分:不同濃度載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針靶向造影劑對HIFU治療后裸鼠殘留肝癌的影響
　　目的:研究高強度聚焦超聲(HIFU)治療裸鼠殘留肝癌后，觀察不同濃度載HSV1-TK基因納米超聲分子探針靶向造影劑對裸鼠殘留肝癌組織中TK基因表達的影響。
　　方法:建立裸鼠肝癌模型50只，隨即分成五組，每組10只，使用HIFU治療儀對裸鼠消融80％后，經(jīng)裸

15、鼠尾靜脈注入不同濃度載納米超聲分子探針靶向造影劑，然后用超聲輻照。免疫組化及Western-blot檢測TK蛋白的表達情況，Real-time PCR檢測TK mRNA表達情況，用TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡情況，繪制抑瘤曲線。
　　結(jié)果:免疫組化及Real-time PCR及Western-blot及抑瘤率及調(diào)亡指數(shù)均顯示與A組相比，B、C、D、E組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而C、D、E組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。<