基因重組HSV-TK腺相關病毒聯(lián)合GCV治療膀胱癌的實驗研究.pdf

1、膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計大約75％的病例為淺表性膀胱癌，其中95％為高危淺表性腫瘤。高危淺表性腫瘤術后若不給予任何藥物治療，其近期復發(fā)率為60％-90％。手術、放療、化療構成了腫瘤治療的三大模式。這些治療方法基本都著眼于直接殺傷腫瘤細胞，常難徹底消滅腫瘤細胞又易傷及正常組織，特別是在治療的同時會傷害在機體抗腫瘤防御機制中占重要地位的免疫系統(tǒng)，尤其是影響機體的細胞免疫。在現(xiàn)代分子生物學和基因工程技術的飛速發(fā)展的推動下，

2、腫瘤的生物學治療日益受到人們的重視，顯示出良好的應用前景，成為腫瘤治療的第四模式?；蛑委熓巧飳W治療的一個重要組成部分。其發(fā)展已有近三十年的歷史，在腫瘤治療中最具有潛力。據(jù)統(tǒng)計至1996年底，全世界接受基因治療的患者總數(shù)達2103人，其中惡性腫瘤占68.8％。 眾多學者關注的自殺基因治療是利用基因工程技術將一些病毒或細菌基因組中前藥轉換酶基因(也叫自殺基因)導人腫瘤細胞，該基因編碼特殊的酶，可使原先對哺乳動物細胞無毒性的前藥在

3、腫瘤細胞中代謝為毒性產物，從而引起這些細胞的死亡，所以又稱為“病毒導向的酶解前藥療法”或“分子化療”。胸苷激酶(TK)基因治療就是其中之一，且其研究取得了令人矚目的成就。該酶可將核苷類似物(NA)代謝為二磷酸化物，后者在細胞內酶的作用下生成有毒的三磷酸化物而發(fā)揮抗腫瘤作用，同時其能選擇性地使抗病毒藥物環(huán)氧鳥苷(GCV，目前腫瘤TK基因治療中最常用的前藥)磷酸化成為單磷酸化產物，并在細胞內磷酸激酶的作用下形成三磷酸產物，干擾、阻斷DNA的

4、正常合成和細胞增生。在腫瘤的治療中，單純皰疹病毒．胸苷激酶(HSV-TK)基因被認為最有效，也是唯一被批準進入臨床試驗的自殺基因。其可將GCV轉化為三磷酸GCV，后者代替脫氧三磷酸鳥苷酸結合于DNA鏈，阻止DNA鏈延長，選擇性殺傷處于增殖分裂期的自殺基因細胞。 介導HSV-TK的真核表達載體主要有逆轉錄病毒(Retrovims)、腺病毒(Ad)、腺相關病毒(AAV)等；也可不經(jīng)載體介導直接將質粒裸DNA進行轉導。在已經(jīng)報道的各種

5、涉及HSV-TK基因治療的體內外試驗中，由于選擇的基因轉移方法不同，可使HSV-TK發(fā)揮的作用不盡相同。 本課題借助已被成功包裝為有復制缺陷的含目的基因HSV-TK的腺相關病毒顆粒優(yōu)勢，結合細胞培養(yǎng)和動物飼養(yǎng)技術，進行殺傷膀胱癌細胞及裸鼠膀胱癌模型抑癌作用的實驗研究。該項研究旨在為隨后的動物原位模型體內試驗、含兩個或兩個以上目的基因的腫瘤基因治療實驗等系列研究奠定理論基礎，同時為膀胱癌等腫瘤疾病的治療開拓一個新的研究平臺。

6、 第一部分基因重組HSV-TK腺相關病毒聯(lián)合GCV治療膀胱癌的體外細胞實驗研究 目的： 1．通過觀察基因轉染T24膀胱腫瘤細胞的效果，證明含目的基因HSV-TK的腺相關病毒基因轉染T24細胞的可行性。 2．利用HSV-TK腺相關病毒進行體外T24膀胱腫瘤細胞的實驗研究，觀察其對腫瘤細胞凋亡的影響、細胞生長抑制作用和時間-劑量依賴性。 方法： 1、以rAAV-EGFP轉染T24膀胱腫瘤細胞，來確定

7、腺相關病毒轉染T24細胞的最適MOI值。 2、已被成功包裝為有復制缺陷的含目的基因HSV-TK的腺相關病毒對T24膀胱腫瘤細胞的進行基因轉染并得到鑒定，來研究其可行性。 3、體外培養(yǎng)膀胱腫瘤細胞系T24，接種于96孔板，分別加入rAAV-HSV-TK、 rAAV-MCS重組腺相關病毒顆粒，并加入含不同濃度GCV，以不加GCV的細胞為對照，做MTT試驗，研究rAAV-HSV-TK/GCV系統(tǒng)對T24細胞殺傷的劑量依賴性。

8、 4、體外培養(yǎng)膀胱腫瘤細胞系T24，接種于24孔板，加入rAAV-HSV-TK重組腺相關病毒顆粒，并參照GCV殺傷的劑量依賴性結果，每2天換含不同濃度GCV的新鮮培養(yǎng)液。從加GCV當天起，每天、每濃度做吖啶橙/EB染色計存活細胞，研究rAAV-HSV-TL/GCV系統(tǒng)對T24細胞殺傷的時間依賴性。 5、流式細胞儀判斷T24細胞的凋亡。 6、用10μg/mLGCV作用于rAAV-HSV-TK組細胞24、48、72小時

9、后，流式細胞儀檢測細胞周期及DNA含量的變化，觀察所研究rAAV-HSV-TK/GCV系統(tǒng)對T24膀胱腫瘤細胞周期的影響。 第二部分基因重組HSV-TK腺相關病毒聯(lián)合GCV治療膀胱癌的動物體內實驗研究 目的：構建裸鼠膀胱腫瘤模型，利用HSV-TK腺相關病毒聯(lián)合GCV進行荷瘤裸鼠的實驗研究，分析其抑瘤作用。 方法： 1、T24細胞懸液接種于裸鼠腋窩皮下，接種細胞數(shù)為4×10<'6>，SPF條件下飼養(yǎng)。

10、 2、取已成瘤裸鼠15只，隨機分為3組：空白對照組、rAAV-MCS和 rAAV-HSV-TK組(此組同時每天腹腔注射GCV 3mg/只)，每組5只，測量各組裸鼠移植瘤體積，組間無差異。治療4周后，頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，對移植瘤進行常規(guī)HE染色。各組裸鼠，處死后迅速取心、肝、脾、肺、腎組織，常規(guī)HE染色觀察重組腺相關病毒對各器官是否有影響。 結論：體內外實驗研究顯示宿主細胞可以表達出目的基因，rAAV-HSV-TK/GCV系統(tǒng)