擬南芥中兩種動(dòng)蛋白異型體KatB-KatC生化性質(zhì)及組織分布研究.pdf

1、動(dòng)蛋白是一類依賴于微管的馬達(dá)蛋白，它能利用ATP水解產(chǎn)生的能量沿微管運(yùn)動(dòng)。動(dòng)蛋白具有依賴于核苷酸的微管結(jié)合特性和被微管激活的ATPase特性，這兩個(gè)特性由動(dòng)蛋白的頭部馬達(dá)區(qū)負(fù)責(zé)。動(dòng)蛋白組成一個(gè)龐大的動(dòng)蛋白超家族，廣泛存在真核細(xì)胞，參與了眾多的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞器運(yùn)輸、有絲分裂和減數(shù)分裂、微管的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。擬南芥中存在著61個(gè)動(dòng)蛋白異型體。KatB和KatC是于1993年從擬南芥中最早克隆出的五個(gè)動(dòng)蛋白基因中的兩個(gè)，屬于C端馬

2、達(dá)蛋白，它們所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸同源性高達(dá)84％。雖然其基因很早就被克隆，但有關(guān)二者的生物化學(xué)特性和功能報(bào)道很少。深入研究KatB和KatC的體外生物化學(xué)特性和體內(nèi)組織分布規(guī)律，對(duì)揭示植物動(dòng)蛋白異型體的功能作用具有重要的理論意義。 本研究利用KatC的N-端尾部區(qū)域(128aa)的cDNA序列構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)、純化。與微管的共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，KatCN-端尾部區(qū)域能與微管結(jié)合，而且這種結(jié)合不依賴于ATP。

3、冷CCD熒光顯微觀察結(jié)果表明，KatCN-端尾部區(qū)域不能引起微管的成束。為了確定負(fù)責(zé)與微管結(jié)合的最小區(qū)域，構(gòu)建了6段不同長(zhǎng)度的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了表達(dá)、純化；純化的各刪除片段用來(lái)與微管進(jìn)行共沉淀分析。結(jié)果表明，KatCN端尾部區(qū)域的第74-86aa肽段是負(fù)責(zé)與微管結(jié)合的區(qū)域，而且包含此區(qū)域的不同刪除片段與微管的結(jié)合比不同，說(shuō)明這一微管結(jié)合位點(diǎn)可能是構(gòu)象依賴型的。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，Arg77和Arg79在KatC的N-端尾部區(qū)域

4、與微管結(jié)合的過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用。同時(shí)構(gòu)建、表達(dá)、純化了KatB的除去馬達(dá)區(qū)的385個(gè)氨基酸的片段，其與微管的共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，KatB在尾部區(qū)域同樣也存在著第二個(gè)微管結(jié)合位點(diǎn)。 將含有KatB、KatC桿區(qū)的KatB和KatC區(qū)段分別融合His、GST，各產(chǎn)生了兩種帶不同標(biāo)簽的融合蛋白，通過(guò)Pulldown實(shí)驗(yàn)研究KatB、KatC各自及二者的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KatB、KatC不但各自可以自己相互作用，形成同源二聚體，

5、二者也可以相互作用形成異源二聚體。 用gus作為報(bào)告基因，對(duì)KatB和KatC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gus活性進(jìn)行比較。結(jié)果表明：(1)KatB和KatC啟動(dòng)子在根部都有活性，但具體部位不同。KatC啟動(dòng)子的活性主要集中在根尖分生區(qū)及幼嫩的根毛中。而KatB啟動(dòng)子除了在分生區(qū)有活性外，在中柱內(nèi)及不同發(fā)育時(shí)期的側(cè)根內(nèi)都有較強(qiáng)的活性。(2)KatB啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gus在葉原基、葉脈、葉毛、花藥、果莢中都有活性，但KatC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gus卻只在

6、果莢中有活性。 為了進(jìn)—步了解KatB、KatC在植物體內(nèi)的分布，分別選用KatB特異肽段及KatC的特異肽段為抗原，制備抗血清。經(jīng)親和純化的抗體能夠特異地識(shí)別KatB、KatC而無(wú)免疫交叉反應(yīng)。用免疫印跡對(duì)KatB、KatC在擬南芥中的組織分布進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：KatB在擬南芥中，除了果莢外，在幼苗、根、莖、葉和花中都有表達(dá)，但KatC在葉和花中表達(dá)很弱，卻在果英里表達(dá)較強(qiáng)。 為了了解KatB、KatC在植物體內(nèi)的