兩種酒糟魚風(fēng)味相關(guān)蛋白酶的純化與性質(zhì)分析.pdf

1、酒糟魚是我國(guó)非常重要的一種傳統(tǒng)特色食品，因其保質(zhì)期長(zhǎng)，風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)，深受人們喜愛。在加工發(fā)酵過程中，魚肉中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源和外源蛋白酶的作用下水解生成的多肽、小肽和氨基酸等物質(zhì)，是肉類滋味物質(zhì)的重要來源。但是，關(guān)于蛋白酶對(duì)酒糟魚滋味物質(zhì)和風(fēng)味形成的影響及調(diào)控機(jī)制，迄今仍知之甚少。
　　為了解肌肉內(nèi)源氨肽酶對(duì)酒糟魚風(fēng)味形成的影響，本文采用硫酸銨鹽析、DEAE-Sephacel離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析和羥

2、基磷灰石層析等方法從鮮活青魚的肌肉中分離到一種氨肽酶。肽指紋圖譜對(duì)比分析結(jié)果顯示，該酶與斑馬魚的嘌呤霉素敏感型氨肽酶同源性很高，命名為bcPSA。嘌呤霉素可明顯抑制bcPSA的活性，屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，抑制常數(shù)Ki為0.25μmol/L。該酶的分子量約為100kDa，最適溫度和最適pH分別為40℃和7.5，熱穩(wěn)定性較差。bcPSA能分解多種氨肽酶的熒光底物，其中最適底物為L(zhǎng)ys-MCA和Leu-MCA，對(duì)Lys-MCA、Arg-MCA和

3、Val-MCA熒光底物分解的米氏常數(shù)（Km）分別為4.8μmol/L、2.9μmol/L、3.6μmol/L；最大反應(yīng)速率（Vmax）分別為200nmol·L-1·min-1、210nmol·L-1·min-1、56nmol·L-1·min-1。食鹽和酒精對(duì)bcPSA活性有一定的抑制作用，在3.2％NaCl或5%乙醇條件下，該酶保留其起始活性的58.5%和87.4%。此外，青魚在腌制過程中，肌肉內(nèi)氨肽酶活性下降緩慢，至12天時(shí)仍保持有4

4、1.1%的起始氨肽酶活性。以上數(shù)據(jù)顯示，魚肌肉中的氨肽酶在青魚加工成酒糟魚的過程中，對(duì)其氨基酸增加和風(fēng)味的形成具有潛在的貢獻(xiàn)。
　　同時(shí)，為探討微生物源蛋白酶對(duì)酒糟魚風(fēng)味的影響，采用酪蛋白平板法和紫外分光光度法，從未經(jīng)滅菌的酒糟魚中分離出一株高產(chǎn)蛋白酶菌株。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列比對(duì)鑒定該菌屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），命名為Bs.Lee。該菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為2～8h，進(jìn)入穩(wěn)定期后芽孢開始大量

5、生成，在培養(yǎng)20h后成孢率已達(dá)到90%以上。NaCl對(duì)該菌的生長(zhǎng)有抑制作用，在NaCl濃度為9%時(shí)其OD600值仍為對(duì)照的20%，說明該菌有較強(qiáng)的耐鹽能力。采用蛋白層析純化方法，從該菌30 h的發(fā)酵培養(yǎng)液中分離到一種分子量約為60kDa的蛋白酶。采用酪蛋白酶譜法對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶最適溫度為40℃，最適pH為8.0。10mmol/L的EDTA和EGTA幾乎完全抑制了酶活性，5mmol/L的苯甲脒對(duì)酶活性沒有明顯影響，Ca2+、