人肝臟特異表達基因TCP10L的克隆和功能研究.pdf

1、肝臟是人體多能性器官,具有解毒,物質(zhì)合成,調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝平衡的功能.一些疾病如:肝癌,乙肝,肝硬化會引起肝功能的失調(diào).這些疾病的治療尚依靠于人們對肝功能的進一步了解.以肝癌組織中下調(diào)表達的cDNA片段為探針,我們克隆到一個957bp的cDNA,并命名為TCP10L,利用人16種組織的雜交膜對TCP10L基因的表達譜進行了檢測,Northern雜交結果顯示該基因只在睪丸和肝臟中表達.生物信息學分析表明TCP10L定位于人21q22.11,由

2、5個外顯子和4個內(nèi)含子組成.其轉錄該包含一個645bp的開放閱讀框,編碼一條215個氨基酸的多肽.多肽的N端具有一個典型的亮氨酸拉鏈結構.亮氨酸拉鏈是轉錄因子的基本識別模塊,因此我們用雙熒光酶檢測系統(tǒng)研究了TCP10L基因的轉錄活性.實驗結果顯示與陰性對照相比,TCP10L基因顯著抑制報告基因pGAL45tkLuc在CHO,HEK293和SK-HEP-13種不同的細胞株中的表達.將TCP10L基因的ORF裝到原核表達載體pET32a,并

3、在原核系統(tǒng)E.coli.(BL21DE3)中進行了重組表達.純化到的重組融合蛋白約42kD,并以其為抗原,在新西蘭大白兔中制備了多克隆抗體.利用純化的多克隆抗體,我們在人的睪丸、肝臟等組織進行了免疫組化研究.多克隆抗體在睪丸,肝臟組織有較強的雜交信號,而在其它組織中檢測不到,這與TCP10L的Northern Blot結果相一致.在肝臟組織切片中,雜交信號出現(xiàn)在肝癌和癌旁組織的細胞中,而在結締組織細胞中信號很弱;在睪丸組織切片中,雜交信

4、號在生精小管中出現(xiàn),并且特異的出現(xiàn)在初級精母細胞階段.通過酵母雙雜技術,我們得到了可能與TCP10L基因相互作用的2個基因.一個基因為PMF1,另一個為MAD4基因,這兩個基因都是轉錄因子.鑒于酵母雙雜交存在假陽性,我們將TCP10L基因及PMF1和MAD4進行了亞細胞共定位,以進一步驗證酵母雙雜交的結果.TCP10L基因的表達蛋白(發(fā)紅色光)與PMF1和MAD4表達蛋白(發(fā)綠色光)共同在細胞核中表達,具有較好的重疊性.但這三個基因的表