人肝臟特異表達(dá)基因TCP10L的克隆和功能研究.pdf

1、肝臟是人體多能性器官,具有解毒,物質(zhì)合成,調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝平衡的功能.一些疾病如:肝癌,乙肝,肝硬化會引起肝功能的失調(diào).這些疾病的治療尚依靠于人們對肝功能的進(jìn)一步了解.以肝癌組織中下調(diào)表達(dá)的cDNA片段為探針,我們克隆到一個957bp的cDNA,并命名為TCP10L,利用人16種組織的雜交膜對TCP10L基因的表達(dá)譜進(jìn)行了檢測,Northern雜交結(jié)果顯示該基因只在睪丸和肝臟中表達(dá).生物信息學(xué)分析表明TCP10L定位于人21q22.11,由

2、5個外顯子和4個內(nèi)含子組成.其轉(zhuǎn)錄該包含一個645bp的開放閱讀框,編碼一條215個氨基酸的多肽.多肽的N端具有一個典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu).亮氨酸拉鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄因子的基本識別模塊,因此我們用雙熒光酶檢測系統(tǒng)研究了TCP10L基因的轉(zhuǎn)錄活性.實驗結(jié)果顯示與陰性對照相比,TCP10L基因顯著抑制報告基因pGAL45tkLuc在CHO,HEK293和SK-HEP-13種不同的細(xì)胞株中的表達(dá).將TCP10L基因的ORF裝到原核表達(dá)載體pET32a,并

3、在原核系統(tǒng)E.coli.(BL21DE3)中進(jìn)行了重組表達(dá).純化到的重組融合蛋白約42kD,并以其為抗原,在新西蘭大白兔中制備了多克隆抗體.利用純化的多克隆抗體,我們在人的睪丸、肝臟等組織進(jìn)行了免疫組化研究.多克隆抗體在睪丸,肝臟組織有較強(qiáng)的雜交信號,而在其它組織中檢測不到,這與TCP10L的Northern Blot結(jié)果相一致.在肝臟組織切片中,雜交信號出現(xiàn)在肝癌和癌旁組織的細(xì)胞中,而在結(jié)締組織細(xì)胞中信號很弱;在睪丸組織切片中,雜交信

4、號在生精小管中出現(xiàn),并且特異的出現(xiàn)在初級精母細(xì)胞階段.通過酵母雙雜技術(shù),我們得到了可能與TCP10L基因相互作用的2個基因.一個基因為PMF1,另一個為MAD4基因,這兩個基因都是轉(zhuǎn)錄因子.鑒于酵母雙雜交存在假陽性,我們將TCP10L基因及PMF1和MAD4進(jìn)行了亞細(xì)胞共定位,以進(jìn)一步驗證酵母雙雜交的結(jié)果.TCP10L基因的表達(dá)蛋白(發(fā)紅色光)與PMF1和MAD4表達(dá)蛋白(發(fā)綠色光)共同在細(xì)胞核中表達(dá),具有較好的重疊性.但這三個基因的表