SSB蛋白的克隆、表達(dá)和功能研究.pdf

1、單鏈結(jié)合蛋白(Single-Stranded DNA-Binding Protein，SSB)在DNA復(fù)制、重組和修復(fù)中起著重要作用。為闡明單鏈結(jié)合蛋白SSB的體外生物功能，本研究構(gòu)建了融合蛋白SSB的表達(dá)載體并使其高效表達(dá)并易于純化。ssb基因片段是以E.coli K-12基因組為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，通過基因的體外拼接，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pQE30-ssb。重組菌株M15/pQE30-ssb經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)了SSB蛋白；收集菌

2、體細(xì)胞，經(jīng)超聲波破碎后離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，得到了一條與預(yù)期分子量(19.5 kD)相應(yīng)的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，其表達(dá)量約占全細(xì)胞蛋白的30％且以可溶形式存在。 利用固定化金屬離子(Ni<'2+>)配體親和層析柱和凝膠過濾層析等方法純化融合蛋白SSB，其純度達(dá)到90％。利用表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)對(duì)SSB蛋白的生物功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明：SSB蛋白以四聚體形

3、式與單鏈DNA分子結(jié)合；在有無鎂離子的情況下，兩者的平衡解離常數(shù)(equilibrium dissociation constant，K<,D>)分別為4.79x10<'-7>M和9.67x10<'-7>M；闡明了鎂離子對(duì)于兩者作用形式的影響。利用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy，AFM)技術(shù)在單分子水平分別觀察SSB蛋白、ssDNA和SSB-ssDNA復(fù)合物的成像，SSB蛋白分子通過協(xié)同作用于底物ssDNA