陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞技術(shù)體系的建立.pdf

1、利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000與pBac[A3Neo+A3EGFP]表達(dá)載體，對(duì)BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四種細(xì)胞系進(jìn)行了DNA量、脂質(zhì)體量、血清含量和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度及轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染液孵育時(shí)間等五個(gè)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)選擇轉(zhuǎn)染效率最高的BmN-SWU1細(xì)胞用G418進(jìn)行篩選，完成了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的建立。其主要研究結(jié)果如下： 1．DNA量的優(yōu)化。優(yōu)化時(shí)在五個(gè)培養(yǎng)孔中分別接種密度為2×

2、10<'5>個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液0.5 mL，每孔加入2μl脂質(zhì)體，DNA量毆置了0.4 μg、0.6/μg、0.8μg、1.0μg和1.2μg五個(gè)質(zhì)量梯度，無血清轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后移除轉(zhuǎn)染液。優(yōu)化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四種細(xì)胞系的最優(yōu)DNA量分別為0.6μg、0.4μg、1.0μg和0.6μg。 2．脂質(zhì)體量的優(yōu)化。優(yōu)化時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)板的五個(gè)培養(yǎng)孔中分別接種密度為 2×10<'5>個(gè)/mL

3、的細(xì)胞懸液0.5 mL，每孔加入0.6μg質(zhì)粒DNA，脂質(zhì)體量設(shè)置了1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl和3.0μl五個(gè)體積梯度，無血清轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后移除轉(zhuǎn)染液。優(yōu)化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四種細(xì)胞系的最優(yōu)脂質(zhì)體量分別為2.5μl、1.5μ1、3.0μl和3μl。 3．被轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度的優(yōu)化。在細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中分別接種密度為0.5×10<'5>個(gè)/mL、1×10<'5>個(gè)/m

4、L、2×10<'5>個(gè)/mL、3×10<'5>個(gè)/mL和4×10<'5>個(gè)/mL的BmN-SWU1、BmN和Sf21細(xì)胞0.5 mL，優(yōu)化BmN-SWU2時(shí)，在培養(yǎng)孔中分別接種密度為1×10<'5>個(gè)/mL、2×10<'5>個(gè)/mL、3×10<'5>個(gè)/mL、4×10<'5>個(gè)/mL和5×10<'5>個(gè)/mL的細(xì)胞0.5 mL。每孔加入0.6μg質(zhì)粒DNA，2μl脂質(zhì)體，無血清轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后移除轉(zhuǎn)染液。優(yōu)化后得到了BmN-SWUI

5、、BmN-SWU2、BmN和Sf21等四種細(xì)胞系的最優(yōu)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度分別為1×10<'5>個(gè)/mL、5×10<'5>個(gè)/mL、2×10<'5>個(gè)/mL和0.5×10<'5>個(gè)/mL。 4．共轉(zhuǎn)染時(shí)間的優(yōu)化。在培養(yǎng)孔中分別接種密度為2×10<'5>個(gè)/mL的BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21細(xì)胞懸液0.5 mL，每孔加入0.6μg質(zhì)粒DNA，2μl脂質(zhì)體，無血清轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后于6h、12 h、18 h、24 h和3

6、0h時(shí)移除轉(zhuǎn)染液。優(yōu)化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四種細(xì)胞系的最優(yōu)共轉(zhuǎn)染時(shí)間分別為24 h、6 h、24 h和12 h。 5．轉(zhuǎn)染液中血清含量的優(yōu)化。在培養(yǎng)孔中分別接種密度為2×10<'5>個(gè)/mL的BmN-SWU1、BmN和Sf21細(xì)胞懸液0.5 mL，分別加入無血清和有血清(5％)轉(zhuǎn)染液；而優(yōu)化BmN-SWU2時(shí)，在培養(yǎng)孔中分別接種密度為2×10<'5>個(gè)/mL的BmN-SWU2細(xì)胞懸液0.5 mL，

7、分別加入含2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％血清的轉(zhuǎn)染液。每孔轉(zhuǎn)染液中加入0.6μg質(zhì)粒DNA，2μl脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染24 h后移除轉(zhuǎn)染液。優(yōu)化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染最優(yōu)血清條件分別為無血清、5％血清、無血清和5％血清。 6．在BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四種細(xì)胞系各自最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到了四種細(xì)胞系的最高瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率分別為55.08％、8.

8、29％、2.0％和11.66％。 7．選用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高的BmN-SWU1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用G418篩選，構(gòu)建的BmN-SWU1的(3418致死曲線表明，300 μg/mL是BmN-SWU1細(xì)胞對(duì)(3418的最小致死濃度。用400μg/mL的G418篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞14 d，得劍了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞占60％以上的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞群體。挑取轉(zhuǎn)基因細(xì)胞群體用200μg/mL的G418篩選五個(gè)月左右，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞占95％以上的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞群體。目前，轉(zhuǎn)基

9、因細(xì)胞群體已連續(xù)傳至15代，且能在6-8 d傳代一次，與未轉(zhuǎn)染的BmN-SWU1細(xì)胞傳代時(shí)間相當(dāng)。 本研究優(yōu)化了陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf2四個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件，建立了陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞的技術(shù)體系，其中BmN-SWU1細(xì)胞系的最高轉(zhuǎn)染效率達(dá)到55.08％，并且篩選出了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞占95％以上的BmN-SWU1細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，為分析家蠶轉(zhuǎn)基因載體的表