細(xì)胞周期因子geminin調(diào)控斑馬魚(yú)心臟發(fā)育的初步研究.pdf

1、在脊椎動(dòng)物的發(fā)育中，心臟是最早形成并有功能的器官之一，由于它的功能非常重要并且較其他器官也易于觀(guān)察因此也是最早被研究的器官。斑馬魚(yú)的胚胎體外受精，完全透明，且生長(zhǎng)速度很快，是研究心臟發(fā)育的最好模式動(dòng)物之一。斑馬魚(yú)的心臟發(fā)育過(guò)程中有幾個(gè)關(guān)鍵的步驟，任意一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都有可能導(dǎo)致心臟的先天性畸形。所以研究某個(gè)重要基因?qū)δ硞€(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控能夠?yàn)槿祟?lèi)先天性心臟畸形的致病機(jī)理提供理論依據(jù)，為醫(yī)學(xué)診斷提供有利的工具。 Geminin是細(xì)胞周期

2、的重要調(diào)控因子，在細(xì)胞周期中能和Cdt1結(jié)合阻止DNA的再次復(fù)制。在斑馬魚(yú)中研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)Geminin或者降低Gdt1的表達(dá)能減少有絲分裂的細(xì)胞數(shù)量，并且這種對(duì)細(xì)胞周期的效應(yīng)直接取決于Geminin-Cdt1的相互作用，總之，Geminin和Cdt1的相互作用對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)非常重要。Geminin和cdt1的相互作用對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)非常重要，但到目前為止關(guān)于geminin對(duì)器官發(fā)育的影響的報(bào)道非常少。因此研究geminin在心臟

3、這個(gè)重要器官中發(fā)育中的作用就顯得很有意義。本論文就初步研究了geminin對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育的影響。 本研究首先確定了geminin對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育的哪個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)生了影響。該研究應(yīng)用原位雜交的方法通過(guò)檢測(cè)心臟marker基因nkx2.5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)阻斷geminin的表達(dá)后nkx2.5的表達(dá)范圍擴(kuò)增了，也就是說(shuō)geminin影響了心臟前體細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化，它抑制了非心臟區(qū)域nkx2.5的誘導(dǎo)。進(jìn)一步的觀(guān)察又發(fā)現(xiàn)，阻斷geminin表

4、達(dá)的胚胎在48h的時(shí)候較野生型的心臟在外形上有明顯的缺陷，心房心室之間的loop角度發(fā)生了變化，有的心臟心室呈豎一字形排列，部分胚胎的心室心房的偏轉(zhuǎn)完全相反，心臟的體位也隨之相反，并且這一表型的胚胎比例可以達(dá)到三分之一，說(shuō)明注射GemMO后的第二個(gè)明顯表型就是心臟發(fā)育的左右不對(duì)稱(chēng)模式發(fā)生了改變。 隨后研究了geminin導(dǎo)致心臟前體細(xì)胞數(shù)量的增加和心臟左右不對(duì)稱(chēng)模式的改變是否有相關(guān)性。我采用了同樣能擴(kuò)大nkx2.5表達(dá)的工具BM

5、S453處理胚胎并統(tǒng)計(jì)表型，發(fā)現(xiàn)BMS處理過(guò)后果然有相當(dāng)數(shù)量的胚胎(20％左右)呈現(xiàn)了loop相反的表型，一定程度模擬了注射GemMO的表型。另外根據(jù)Geminin和Cdt1的平衡在細(xì)胞周期中的作用，我將GemMO+Cdt1MO共同注射發(fā)現(xiàn)Cdt1MO一定程度上rescue了loop相反的表型。另一方面，還研究了geminin對(duì)胚胎發(fā)育左右平衡模式的影響。發(fā)現(xiàn)，阻斷geminin表達(dá)之后調(diào)節(jié)胚胎左右平衡發(fā)育的重要因子bmp4的表達(dá)模式發(fā)

6、生了改變。由野生型的左強(qiáng)右弱的表達(dá)，變化到左右表達(dá)強(qiáng)弱相當(dāng)，還有大部分胚胎呈現(xiàn)右強(qiáng)左弱的表達(dá)。而同時(shí)注射GemMO+Cdt1MO則能rescue對(duì)bmp4的影響。這就說(shuō)明geminin還影響了胚胎發(fā)育的左右平衡。并且這種影響仍然能被Cdt1MO拯救。已有研究表明，斑馬魚(yú)心臟的loop方向和bmp4的表達(dá)模式是相對(duì)應(yīng)的。即如果bmp4表達(dá)左強(qiáng)右弱，對(duì)應(yīng)形成的心臟方向就是正常的位于左側(cè)，心室向右偏轉(zhuǎn)，心房左偏轉(zhuǎn)；如果表達(dá)左右強(qiáng)弱相當(dāng)，則對(duì)應(yīng)

7、形成的心臟就位于身體的中間，心室心房成豎一字形；如果表達(dá)右強(qiáng)左弱，則對(duì)應(yīng)心臟位于右側(cè)，心室左偏轉(zhuǎn)，心房右偏轉(zhuǎn)。這正好對(duì)應(yīng)了前面對(duì)心臟loop方向的觀(guān)察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。所以我們可以認(rèn)為geminin還通過(guò)改變bmp4的表達(dá)模式，影響了bmp4下游的一些途徑和因子從而改變了心臟loop的方向，這一途徑是與胚胎發(fā)育的左右平衡模式相關(guān)的。為了再確認(rèn)這一點(diǎn)，我又檢測(cè)了影響胚胎左右不對(duì)稱(chēng)發(fā)育的pitx2c，lefty2和ntl基因，發(fā)現(xiàn)注射了GemMO之