肌肉細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2A（MEF2A）在斑馬魚心臟和體節(jié)發(fā)育中的作用.pdf

1、肌肉細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2基因(Myocytespecifific-enhancerfactor2，MEF2)廣泛存在于果蠅、斑馬魚、小鼠和人類中。在小鼠和人類中，MEF2基因家族至少存在4個(gè)成員：MEF2A,MEF2B,MEF2C和MEF2D。其中MEF2A在骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育、分化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人類家系遺傳分析表明突變的MEF2A是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的致病基因之一，這一致病基因的發(fā)現(xiàn)為研究冠心病的發(fā)病機(jī)理、開發(fā)預(yù)防和治療相關(guān)的新藥

2、具有重要價(jià)值。分子遺傳學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)冠心病患者中近2﹪可能攜帶有MEF2A突變基因，這就提示MEF2A基因突變與冠心病及心梗有直接相關(guān)性，MEF2A基因在冠心病發(fā)病過(guò)程中有重要功能，但具體機(jī)制尚不清楚。最近，上述結(jié)論引起爭(zhēng)議。MEF2A基因敲除小鼠出生后死于猝死，MEF2A雜合性突變體小鼠出生后發(fā)育正常，MEF2A-/-小鼠死因不明。 模式生物作為研究基因功能的一種新型的研究方法，斑馬魚胚胎透明、體外發(fā)育、個(gè)體小、繁殖率高、產(chǎn)卵時(shí)

3、間長(zhǎng)、以及魚種發(fā)育遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)使其正成為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)的理想模式生物。斑馬魚屬于脊椎動(dòng)物，其心血管、血液、消化道、肝臟、腎臟以及視覺(jué)系統(tǒng)與人類相應(yīng)系統(tǒng)有許多共同特點(diǎn)。用該模型闡明早期發(fā)育、器官形成、系統(tǒng)生理學(xué)、藥理學(xué)和復(fù)雜疾病等問(wèn)題均切實(shí)可行。2000年，Nasevicius等提出了注射嗎啡啉修飾性寡核苷酸可獲得基因下調(diào)斑馬魚。嗎啡啉有抑制翻譯的起始，減少傳統(tǒng)反義寡核苷酸非特異性的效應(yīng)。注射嗎啡啉能夠產(chǎn)生以往證

4、實(shí)的基因突變的擬表型，有助于確定未知功能的基因。嗎啡啉寡核苷酸正在成為快速、高效的基因敲除方法，使經(jīng)典反向遺傳學(xué)方法應(yīng)用于斑馬魚。 斑馬魚具有許多適合心血管系統(tǒng)疾病研究的優(yōu)勢(shì)，斑馬魚的心臟容易觀察和便于操作，更有意義的是，由于它的胚胎小，可以不依賴于有功能的心血管系統(tǒng)，甚至在整個(gè)心血管循環(huán)缺失的情況下，它仍然能通過(guò)對(duì)氧的被動(dòng)運(yùn)輸而生存，繼續(xù)發(fā)育一段時(shí)間，這就可以活體觀察心血管系統(tǒng)有嚴(yán)重缺陷的突變體，為心血管發(fā)育遺傳學(xué)研究提供極

5、為有利條件亡，此外，斑馬魚與人類的心臟發(fā)育具有極其相似的基因調(diào)控途徑，因此進(jìn)行斑馬魚的心臟發(fā)育機(jī)制研究，對(duì)揭示人類心臟發(fā)育的基因調(diào)控機(jī)理有重要的啟示意義，這使得斑馬魚成為進(jìn)行心臟發(fā)育生物學(xué)研究的重要模式動(dòng)物之一，極大地推動(dòng)心血管疾病發(fā)病機(jī)制的研究。 應(yīng)用斑馬魚正向遺傳學(xué)(forwardgenetics)研究已鑒定了多個(gè)影響心臟收縮功能的突變體。突變體weakatrium心房停止跳動(dòng)，而心室正常節(jié)律性收縮；silentheart

6、是心臟收縮功能缺陷最嚴(yán)重的突變體，其心房和心室都停止跳動(dòng)，但心房和心室外形發(fā)育正常；突變體quietheart心房和心室?guī)缀跬Ｖ固鴦?dòng)，但心房和心室外形發(fā)育正常；突變體stretched心房和心室跳動(dòng)但無(wú)血液循環(huán)，胚胎發(fā)育到48小時(shí)時(shí)，純合子突變體stretched嚴(yán)重水腫，整個(gè)心臟形成針樣結(jié)構(gòu)。定位克隆結(jié)果證明上述突變基因是形成肌節(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的相應(yīng)編碼基因，心肌肌原纖維由粗、細(xì)肌絲規(guī)律排列組成，心肌肌節(jié)是心肌收縮的基本元件，肌絲的滑動(dòng)

7、是心肌收縮的動(dòng)力基礎(chǔ)。構(gòu)成肌節(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)突變可導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病或肥厚型心肌病，甚至心力衰竭。到目前為止，在大規(guī)模斑馬魚遺傳篩選中，還沒(méi)有突變體的突變基因遺傳定位到MEF2A位點(diǎn)。 BMP-2是參與胚胎早期分化發(fā)育的又一個(gè)因子，有趣的是，發(fā)育后期機(jī)體BMP-2基因仍有表達(dá)，提示BMP-2基因在發(fā)育后期仍有生物學(xué)功能，但BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎7.0-10.5天時(shí)就死亡，妨礙了探討B(tài)MP-2基因在發(fā)育后期的功能。

8、 到目前為止，還沒(méi)有直接的遺傳學(xué)證據(jù)表明BMP-2調(diào)節(jié)心臟收縮。本研究得利于斑馬魚在心血管發(fā)育遺傳學(xué)中的優(yōu)勢(shì)，BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎死亡，所以用小鼠模型研究發(fā)育后期BMP-2基因功能很困難。相反，斑馬魚胚胎發(fā)育并不完全依賴有功能的心血管系統(tǒng)，環(huán)境中的氧可以擴(kuò)散進(jìn)入胚胎機(jī)體。這就為探討B(tài)MP-2基因功能提供可能。我們實(shí)驗(yàn)證明，心肌細(xì)胞可以合成并分泌BMP-2，BMP-2不僅是背腹分化所必需的，也是維持心臟收縮所不可缺的。

9、 新生大鼠心肌細(xì)胞模型作為一種體外實(shí)驗(yàn)研究模型，可以更方便地從細(xì)胞和分子水平研究心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，成為心血管疾病研究的一項(xiàng)主要手段和基本技術(shù)。 體節(jié)發(fā)育過(guò)程受多種遺傳因子調(diào)節(jié)，有趣的是斑馬魚前6個(gè)體節(jié)每20分鐘形成1個(gè)體節(jié)，而后24個(gè)體節(jié)每30分鐘形成1個(gè)體節(jié)，表明前部體節(jié)和后部體節(jié)發(fā)育機(jī)理不完全相同。斑馬魚大規(guī)模遺傳篩選獲得多個(gè)體節(jié)發(fā)育缺陷突變體，還沒(méi)有突變體遺傳定位到MEF2A位點(diǎn)。 第一部分MEF2A在

10、斑馬魚心臟發(fā)育中的作用 本部分研究擬利用斑馬魚在心血管發(fā)育遺傳學(xué)優(yōu)勢(shì)，探討MEF2A基因在斑馬魚心臟發(fā)育中的作用。 首先，利用RT-PCR，胚胎整體原位雜交和MEF2A：GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的動(dòng)態(tài)分析等多種手段探討MEF2A在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式，表明MEF2A在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中在心臟及體節(jié)中有表達(dá)，在心臟中的表達(dá)提示MEF2A在心臟發(fā)育中有某種特定功能。 其后，利用嗎啡啉修飾的寡核苷酸技術(shù)在整體水平下調(diào)

11、(knock-down)MEF2A基因的表達(dá)，探討其異常表型及其機(jī)制。發(fā)現(xiàn)： 1.胚胎發(fā)育到48小時(shí)時(shí)，胚胎心臟形態(tài)發(fā)生正常。但心臟收縮頻率降低，心室收縮指數(shù)降低，心肌收縮力降低，整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示MEF2A參與心臟的收縮功能。 2.心肌電鏡結(jié)果提示MEF2A參與心肌肌節(jié)的組裝，MEF2A功能下調(diào)導(dǎo)致心肌肌節(jié)的組裝紊亂，細(xì)胞水平證明MEF2A的功能完整是心臟正常收縮所必需的。 3.Real-TimePCR、原

12、位免疫熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù)顯示MEF2A的表達(dá)下調(diào)能導(dǎo)致參與心肌收縮基因的表達(dá)異常，這些收縮基因的表達(dá)產(chǎn)物收縮蛋白是形成心肌肌節(jié)的基本元件，是參與心肌收縮的動(dòng)力裝置。從分子水平證明MEF2A參與心臟的收縮功能。 第二部分BMP2作用于MEF2A上游調(diào)節(jié)心臟收縮 第一部分我們提供了MEF2A調(diào)節(jié)心臟收縮的功能的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，MEF2A作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其上游的調(diào)節(jié)機(jī)制還很少有報(bào)道。 本部分研究綜合利用斑馬魚和心肌細(xì)胞模

13、型，首先，分析了斑馬魚、大鼠和人的BMP-2和MEF2A高度同源；其次，證明BMP-2和MEF2A在胚胎心臟中共同表達(dá)；再次，提供BMP2調(diào)節(jié)心臟收縮的遺傳學(xué)證據(jù)；第四，用生化手段證明BMP-2可以調(diào)控新生大鼠心室心肌細(xì)胞MEF-2A的表達(dá)；第五，用功能恢復(fù)手段證明MEF2A作用于BMP2下游調(diào)節(jié)心臟收縮；第六，提出BMP2-MEF2A通路調(diào)節(jié)心臟收縮的模型，分析靶向BMP2-MEF2A通路可以為心力衰竭的防治提供新的手段。

14、第三部分MEF2A在斑馬魚體節(jié)發(fā)育中的作用 第一部分我們證明MEF2A在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中在體節(jié)中有表達(dá)，在體節(jié)中的表達(dá)提示MEF2A在體節(jié)發(fā)育中有某種特定功能。 體節(jié)發(fā)育過(guò)程受多種遺傳因子調(diào)節(jié)，有趣的是斑馬魚前6個(gè)體節(jié)每20分鐘形成1個(gè)，而后24個(gè)體節(jié)每30分鐘形成1個(gè)，表明前部體節(jié)和后部體節(jié)發(fā)育機(jī)理不完全相同。斑馬魚大規(guī)模遺傳篩選獲得多個(gè)體節(jié)發(fā)育缺陷突變體，還沒(méi)有突變體遺傳定位到MEF2A位點(diǎn)。 本部

15、分研究利用斑馬魚在體外發(fā)育、胚胎透明、發(fā)育快速的特點(diǎn)，探討MEF2A基因在斑馬魚在體節(jié)的作用。利用嗎啡啉修飾的寡核苷酸技術(shù)在整體水平下調(diào)MEF2A基因的表達(dá)，探討體節(jié)發(fā)育缺陷表型其異常表型，發(fā)現(xiàn) 1.斑馬魚胚胎MEF2A下調(diào)后尾部向下彎曲，形成U型的后部體節(jié)； 2.MEF2A是Hedgehog通路所必需的，盡管MEF2A不影響shh，ehh的表達(dá)； 3.MEF2A下調(diào)后導(dǎo)致后部體節(jié)凋亡增加； 4.

16、Hedgehog信號(hào)抑制MEF2A的表達(dá)； 5.利用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)探討MEF2A基因下調(diào)后的基因表達(dá)改變， 為研究MEF2A下游的靶基因提供的源泉。 上述實(shí)驗(yàn)證明MEF2A是斑馬魚后部體節(jié)發(fā)育所必需的 第四部分Wortmannin誘導(dǎo)斑馬魚“雙心畸形” 本論文第一、二部分我們證明BMP-2及MEF2A調(diào)節(jié)心臟收縮的功能，等報(bào)道磷脂酰肌醇激酶3(PI-3-K)可以負(fù)性調(diào)節(jié)離體培養(yǎng)心肌細(xì)

17、胞的收縮，我們想探討PI-3-K能否調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎心臟收縮，與BMP-2及MEF2A之間有無(wú)某種調(diào)節(jié)作用，我們用一種很常用的PI-3-K的抑制劑wortmannin誘導(dǎo)斑馬魚胚胎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理的胚胎“雙心畸形”的表型，引起我們的關(guān)注。 本部分我們首次報(bào)道wortmannin誘導(dǎo)斑馬魚胚胎“雙心畸形”。首先用原位免疫熒光方法及整體原位雜交的方法證明wortmannin可誘導(dǎo)二個(gè)獨(dú)立的心臟，再次，證明wortmannin誘導(dǎo)斑馬魚