PADI4在ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化過(guò)程中的作用及其信號(hào)通路調(diào)控研究.pdf

1、背景：
　　白血病是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，因白血病細(xì)胞自我更新增強(qiáng)、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段，是導(dǎo)致人類死亡的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，白血病每年發(fā)病率約為3-4/105，約占惡性腫瘤總發(fā)病率的5％，我國(guó)每年新增白血病患者40000多例，其中20000多例患者是兒童。骨髓移植(Bonemarrow transplantation，BMT)是急性白血病最有效治療方法，但受費(fèi)用昂貴，風(fēng)險(xiǎn)大

2、，HLA相同的供體不足等條件限制，且移植后合并癥較多，早期死亡率高，在國(guó)內(nèi)推廣使用尚有困難。目前，白血病屬于血液系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，大部分仍無(wú)法徹底治愈,聯(lián)合化療仍是急性白血病的主要治療手段。
　　近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸(All-Trans-Retinoic Acid，ATRA)又名維A酸，其他名如維甲酸、維 A甲酸等，化學(xué)名稱為(13E)分子式為 C20H2802，主要是維生素 A酸的衍生物，為維生素 A在體內(nèi)的中間代

3、謝產(chǎn)物，是維持生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的物質(zhì),可以誘導(dǎo) VSMC分化及抑制 VSMC增殖。維甲酸受體（retinoic acid receptor,RAR）是一種重要的細(xì)胞核受體，有α、β、γ三種亞型，在VSMC中存在的RARα與ATRA結(jié)合后誘導(dǎo) VSMC分化。Krüppel樣因子4（krüppel-like factor, KLF4）是含有鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子,在 VSMC增殖、分化、遷移及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此 ATRA具有很強(qiáng)的

4、誘導(dǎo)細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)作用，是目前國(guó)內(nèi)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocyticleukemia，APL)、骨髓異常增生等血液惡性疾病的臨床首選藥.
　　肽?；彼崦搧啺访?-PADI4（Peptidylarginine deiminase4），包含2238個(gè)堿基對(duì)，編碼663個(gè)氨基酸，分子量為67KDa，廣泛分布于動(dòng)物組織中，其編碼的酶可以催化精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基，此過(guò)程稱為瓜氨酸化。該過(guò)程需要Ca

5、2+的協(xié)助，轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基的蛋白構(gòu)象也發(fā)生改變，從而導(dǎo)致酶的活性變化。已有研究表明在不同的實(shí)體瘤中PADI4高表達(dá)，在HL-60等不同類型的白血病細(xì)胞株中PADI4的表達(dá)情況有所不同PADI4在造血細(xì)胞中很少表達(dá)，但是在經(jīng)ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中可以檢測(cè)到PADI4的表達(dá)，因此考慮PADI4和白血病細(xì)胞的分化與凋亡有關(guān)。但是在生理狀態(tài)下，PADI4在白血病的分化過(guò)程中的功能及其作用的機(jī)制還不是很明確。<

6、br>　　有報(bào)道表明全反式維甲酸可以明顯的誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60向粒系分化。部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)在白血病的治療過(guò)程中，MAPK, PI3K/Akt和NF-κB等信號(hào)通路參與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡的過(guò)程。
　　其中ERK1/2是MAPK家族成員，分子量分別為44kDa和42kDa，磷酸化的P44/42有介導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄活化的作用，并參與細(xì)胞增殖與分化。PI3K/Akt通路廣泛存在細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通

7、r>　　因此，本研究擬以ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞為分化模型，初步探討PADI4在白血病細(xì)胞分化過(guò)程中的變化規(guī)律，并進(jìn)一步深入探討PADI4參與ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化過(guò)程中MAPK, PI3K/Akt和NF-κB等信號(hào)通路是否發(fā)揮作用，揭示PADI4影響白血病細(xì)胞分化的分子機(jī)制。這為白血病的新治療方案提供了重要的理論依據(jù)，對(duì)治療白血病有著重大的意義。
　　目的：
　　本課題在以上研究背景的基礎(chǔ)上，探討在全反式維甲酸誘

8、導(dǎo)早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞向粒系分化過(guò)程中PADI4的表達(dá)變化與功能機(jī)制。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討PADI4基因與白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞分化是否有關(guān)為切入點(diǎn)，重點(diǎn)觀察HL60細(xì)胞經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)向粒系分化后PADI4表達(dá)變化，以及調(diào)控PADI4表達(dá)后對(duì)MAPK, PI3K/Akt和NF-κB等信號(hào)通路影響，擬驗(yàn)證PADI4基因與白血病的關(guān)系，為白血病的臨床治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)

9、胞24 h、48 h、72 h、96 h后，應(yīng)用Wright-Gimesa染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CD11b的表達(dá)變化；應(yīng)用RT-PCR分析PADI4在基因水平的表達(dá)趨勢(shì)，Western blot的方法檢測(cè)PADI4在蛋白水平的表達(dá)變化；RNAi技術(shù)干擾PADI4及PADI4抑制劑后流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b變化，Western blot檢測(cè)PADI4、P42/44、P65、P105、P55等蛋白水平變

10、化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試用spss17.0軟件。
　　結(jié)果：
　　HL-60細(xì)胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后與對(duì)照組相比，Wright-Gimesa染色顯示細(xì)胞核明顯縮小，核仁消失．胞漿變多，核漿比明顯減小，核有凹陷及分葉，桿狀核、分葉核現(xiàn)象明顯增多；細(xì)胞表面分子CD11b表達(dá)由2.1%升高到48.9%（P<0.05）；隨著ATRA誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)PADI4在基因和蛋白水平都有增高趨勢(shì)；干擾PADI4表達(dá)后，或者使用PADI4抑制劑后再用ATRA