ERK-p38信號(hào)通路在MTA誘導(dǎo)的人根尖乳頭細(xì)胞分化過程中的作用.pdf

1、目的
　　絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)信號(hào)通路是真核細(xì)胞將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)至胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等細(xì)胞反應(yīng)的傳導(dǎo)中起重要作用。人根尖乳頭細(xì)胞(humanapicalpapillacells，HAPCs)具有多向分化潛能，是組織工程和生物牙根構(gòu)建的種子細(xì)胞。無機(jī)三氧化物聚合體(mineraltrioxideaggregate，MTA)已

2、廣泛應(yīng)用于根尖誘導(dǎo)成形術(shù)，并且取得了良好的效果。然而，MTA在HAPCs分化中的作用和分子機(jī)制目前還不清楚，本文擬探討MAPKs信號(hào)通路在MTA誘導(dǎo)HAPCs分化過程中的作用。
　　方法
　　第一部分:人根尖乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及體外誘導(dǎo)分化
　　酶消化法分離培養(yǎng)人根尖乳頭細(xì)胞，傳代后獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞。礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)三周后，茜素紅染色顯示誘導(dǎo)組形成大量礦化結(jié)節(jié)，對(duì)照組僅有少量散在礦化結(jié)節(jié)形成。
　　第二部分:M

3、TA對(duì)人根尖乳頭細(xì)胞增殖和分化的影響
　　應(yīng)用不同濃度MTA培養(yǎng)細(xì)胞，通過CCK-8檢測(cè)MTA對(duì)HAPCs增殖的影響，結(jié)果顯示10mg/ml和20mg/mlMTA對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(p＜0.05)，低濃度MTA對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。使用MTA條件培養(yǎng)基(0、0.02mg/ml、0.2mg/ml、2mg/ml)誘導(dǎo)HAPCs的分化，檢測(cè)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性，茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)的

4、形成;通過real-timePCR檢測(cè)牙本質(zhì)特異性標(biāo)記物牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein，DSPP)以及成骨相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子(runt-relatedtranscriptionfactor2，Runx2)、骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)mRNA的表達(dá);WesternBlot檢測(cè)Runx2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示MTA誘導(dǎo)后細(xì)胞ALP活性增強(qiáng);礦化

5、結(jié)節(jié)增多;DSPP、Runx2、BSP、OCNmRNA表達(dá)升高;Runx2的蛋白表達(dá)量升高。以上結(jié)果充分說明MTA促進(jìn)人根尖乳頭細(xì)胞的成牙本質(zhì)/成骨向分化。MTA濃度為0.2mg/ml時(shí)促進(jìn)作用最顯著，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用此濃度為誘導(dǎo)濃度。
　　第三部分:MAPKs信號(hào)通路在MTA誘導(dǎo)的HAPCs分化過程中的作用
　　應(yīng)用WesternBlot檢測(cè)MTA刺激HAPCs后MAPKs信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的變化，結(jié)果顯示，MTA促進(jìn)ER

6、K和p38的磷酸化，表明MTA可以激活ERK和p38信號(hào)通路。
　　在MTA誘導(dǎo)HAPCs分化的同時(shí)，分別用20uM濃度的ERK抑制劑U0126和p38MAPK抑制劑SB203580處理細(xì)胞，檢測(cè)ALP活性，通過real-timePCR和WesternBlot分別檢測(cè)DSPP及其他礦化相關(guān)基因（Runx2、BSP和OCN）mRNA的表達(dá)和Runx2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制ERK和p38的活性后，人根尖乳頭細(xì)胞ALP活性降低;DS