下丘腦室旁核P2X7受體對(duì)大鼠急性心肌梗死損傷的調(diào)控作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:心血管疾病關(guān)乎人類健康與生活質(zhì)量，急性心肌梗死是常見(jiàn)的心血管疾病，其發(fā)病率與致死率逐年上升。如何找到預(yù)防與治療急性心肌梗死損傷的藥物作用靶點(diǎn)及開(kāi)發(fā)治療心肌梗死的相關(guān)藥物成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。該疾病的中樞發(fā)病機(jī)制與治療策略的研究主要集中于中樞心血管調(diào)節(jié)區(qū)，如下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nuclei，PVN)與延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostralventrolateral medulla,

2、RVLM)，其主要通過(guò)炎癥、氧化應(yīng)激等相關(guān)信號(hào)通路對(duì)急性心肌梗死損傷起調(diào)控作用，調(diào)節(jié)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，尚存諸多未解之謎。新近的研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)、致炎細(xì)胞因子合成與釋放，那么中樞PVN內(nèi)炎癥反應(yīng)是否參與對(duì)急性心肌梗死的調(diào)控呢？如果參與，是否與P2X7受體有關(guān)呢？如果有關(guān)，P2X7受體又是如何調(diào)控炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的呢？P2X7受體是通過(guò)何種途徑參與炎癥因子的產(chǎn)生并影響外周交感神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)心肌梗死損傷調(diào)控作用的呢？目

3、前，所有有關(guān)中樞PVN區(qū)P2X7受體調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)的分子機(jī)制仍不清楚。
　　目的:本課題以大鼠急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）損傷模型為研究對(duì)象，研究下丘腦室旁核小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體通過(guò)影響外周交感神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)而調(diào)節(jié)大鼠急性心肌梗死損傷。從形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)角度，觀察AMI組與Sham組大鼠下丘腦室旁核P2X7受體蛋白的表達(dá)。從功能學(xué)角度，觀察AMI組與AMI+si-P2X7組大鼠外周

4、交感神經(jīng)活動(dòng)與心功能的改變，來(lái)證實(shí)中樞PVN通過(guò)P2X7受體參與對(duì)大鼠AMI損傷的調(diào)節(jié)。再者，從形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)角度，觀察AMI組與AMI+si-P2X7組中樞PVN區(qū)催產(chǎn)素(Oxytocin，OT)與血管升壓素(Vasopressin，AP)的表達(dá)，進(jìn)一步判斷P2X7受體通過(guò)腦內(nèi)哪類神經(jīng)元參與對(duì)大鼠AMI的調(diào)控？最后，從分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)角度，觀察中樞PVN內(nèi)促炎細(xì)胞因子(interleukin1β，IL-1β和tumor necr

5、osis factor-α，TNF-α)表達(dá)及促炎細(xì)胞因子上游調(diào)控蛋白caspase-1與P65-NF-κB的表達(dá)，更深一步研究P2X7受體通過(guò)相關(guān)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控大鼠急性心肌梗死損傷。
　　方法:采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法制備大鼠AMI模型，并同時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)，心率(HR)，心室內(nèi)壓(IVP)與左室舒張末期壓(LVEDP)。采用氯化四唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid

6、e，TTC）染色檢測(cè)大鼠急性心肌梗死造模是否成功，蘇木精和伊紅(HE)染色觀察不同心肌缺血時(shí)間點(diǎn)心肌組織病理學(xué)改變。采用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，觀察中樞PVN內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba-1與P2X7受體蛋白共表達(dá)情況;采用蛋白免疫印跡法(westernblot)檢測(cè)各組大鼠（Sham組、AMI組、AMI組+si-RNA組、AMI組+BBG組）PVN內(nèi)P2X7、IL-1β與TNF-α蛋白表達(dá)的變化;同時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(EL

7、ISA)測(cè)定各組大鼠PVN核團(tuán)組織中IL-1β與TNF-α的含量:與此同時(shí)，通過(guò)生物信息采集系統(tǒng)觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌缺血后血流動(dòng)力學(xué)、外周交感神經(jīng)活動(dòng)及心臟自主神經(jīng)變化，并應(yīng)用心率變異性(HRV)分析系統(tǒng)分析大鼠心臟自主神經(jīng)功能狀態(tài)。采用免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)AMI組與AMI+siRNA組大鼠PVN內(nèi)催產(chǎn)素與血管升壓素的表達(dá)，明確P2X7受體經(jīng)釋放炎癥因子激活或敏化中樞內(nèi)哪類神經(jīng)元;采用免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)AMI組與A

8、MI+siRNA組大鼠PVN內(nèi)炎癥細(xì)胞因子上游調(diào)控蛋白Caspase-1與P65-NF-κB的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)大鼠AMI模型的制備:結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，大鼠立即出現(xiàn)心電圖S-T段抬高，結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌發(fā)白，收縮力降低，運(yùn)動(dòng)減弱。TTC染色顯示:心肌缺血區(qū)域發(fā)白;HE染色結(jié)果顯示:隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌梗死程度越嚴(yán)重并伴有心肌纖維溢出;這些結(jié)果證實(shí)了大鼠AMI模型制備成功。
　　(2)激光共聚焦免疫熒

9、光雙標(biāo)結(jié)果顯示:P2X7受體蛋白在大鼠PVN區(qū)與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Iba-1有共表達(dá)，且主要集中于PVN區(qū)域，80％集中表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)而在胞核內(nèi)無(wú)表達(dá)。
　　(3)生物發(fā)光測(cè)定結(jié)果顯示:與Sham組相比，AMI大鼠PVN內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)ATP釋放量迅速增加(P＜0.05，n=6)且呈時(shí)間依賴關(guān)系;在心肌缺血4 h時(shí)間點(diǎn)ATP的釋放量達(dá)最高點(diǎn)，心肌缺血8h后ATP含量逐漸降低。
　　(4) RT-PCR和Western

10、 blot結(jié)果顯示:P2X7R蛋白在各組大鼠PVN中均有表達(dá)，與Sham組相比，AMI組表達(dá)量明顯升高(P＜0.05，n=6)且呈時(shí)間依賴關(guān)系，心肌缺血后4h達(dá)最高峰;與AMI組相比，AMI+P2X7R-siRNA組與AMI+BBG組大鼠PVN內(nèi)P2X7R、IL-1β與TNF-α蛋白與mRNA表達(dá)量均明顯下降(P＜0.05，n=6)。
　　(5) ELISA檢測(cè)方法顯示:與Sham組相比，AMI大鼠PVN內(nèi)IL-1β與TNF-α濃

11、度增高(P＜0.05，n=6);事先PVN內(nèi)給予P2X7R-siRNA或腹腔給予BBG能明顯降低IL-1β與TNF-α濃度(P＜0.05，n=6)。
　　(6)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:與Sham組相比，AMI大鼠PVN區(qū)OT能陽(yáng)性神經(jīng)元與VP能陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目增多(P＜0.05，n=6)，PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA后OT與VP能免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目與AMI組相比明顯降低(P＜0.05，n=6)。與Sham組相比，AMI大鼠P

12、VN區(qū)Caspase-1與P65-NF-κB表達(dá)量增多(P＜0.05，n=6);與AMI組相比，PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA后Caspase-1表達(dá)量明顯減少(P＜0.05，n=6);然而，PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA后P65-NF-κB表達(dá)量與AMI組相比，無(wú)明顯變化(P＞0.05，n=6)。
　　(7)血流動(dòng)力學(xué)與心肌力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:與AMI組大鼠相比，預(yù)先PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA或腹腔內(nèi)預(yù)

13、先給予P2X7受體阻斷劑BBG能使AMI大鼠(AMI+siRNA組、AMI+BBG組)MAP、HR、IVP、LVEDP與HRV(LF/HF)各項(xiàng)指標(biāo)均降低(P＜0.05，n=6)。
　　(8)外周腎交感神經(jīng)活動(dòng)(RSNA)記錄結(jié)果顯示:與Sham組大鼠相比，AMI組大鼠RSNA增強(qiáng)(P＜0.05，n=6);預(yù)先PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA或腹腔內(nèi)預(yù)先給予BBG能使AMI組大鼠RSNA減弱(P＜0.05，n=6)。

14、　　結(jié)論:
　　(1)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制備急性心肌梗死模型，致使外周交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，同時(shí)致AMI大鼠下丘腦PVN內(nèi)P2X7受體蛋白高表達(dá)，可能與心傳入反射有關(guān);與此同時(shí)，高表達(dá)的P2X7受體增強(qiáng)外周交感神經(jīng)活動(dòng)，進(jìn)一步加劇急性心肌梗死損傷。如此的反饋機(jī)制形成一個(gè)惡性循環(huán)過(guò)程，促使大鼠AMI損傷進(jìn)一步惡化。
　　(2) PVN內(nèi)預(yù)先微量注射P2X7R-siRNA或腹腔內(nèi)預(yù)先給予BBG，可以降低PVN內(nèi)IL-1β與TN