燕麥鹽誘導(dǎo)DREB基因的克隆及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相關(guān)DREB基因轉(zhuǎn)化蘆薈的研究.pdf

1、逆境是對(duì)植物生長(zhǎng)和生存不利的各種環(huán)境因素的總稱，又稱脅迫。植物車其生長(zhǎng)周期內(nèi)會(huì)遇到各種各樣外界惡劣環(huán)境的脅迫，如干旱、霜凍、鹽堿和低溫等。脅迫使植物生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，甚至導(dǎo)致植株死亡。這些非生物脅迫造成的危害已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境改良、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素。因此，闡明植物對(duì)環(huán)境脅迫信號(hào)的應(yīng)答機(jī)制，應(yīng)用基因工程手段提高植物的抗逆性，已成為基因工程育種的關(guān)鍵和基礎(chǔ)性工作。為了進(jìn)一步深入研究植物抗逆性的分子機(jī)制，獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)

2、權(quán)的優(yōu)良抗逆基因，我們利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)快速克隆了耐鹽性較強(qiáng)的燕麥中的相關(guān)基因片段，用于植物抗逆性和遺傳工程研究。 DREB(dehyrdration responsive element binding protein)是一類與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠識(shí)別并結(jié)合于與干旱、高鹽及低溫脅迫應(yīng)答有關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域中的DRE(dehydration respon

3、sive element)順式作用元件，啟動(dòng)下游抗逆基因的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多個(gè)抗逆基因。因此，DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠綜合改良植物的抗逆性狀，是迄今為止較為理想的抗逆工程基因。我們采用RACE的方法，首次從燕麥中成功分離了DREB基因片段，該序列全長(zhǎng)1057bp，編碼348個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子量為328.50 Kda。氨基酸序列分析表明該段燕麥DREB基因序列含有一段核定位信號(hào)(NLS)以及氨基酸的DNA結(jié)合域(EREBP/AP

4、2)保守區(qū)，屬于EREBP/AP2基因家族。燕麥DREB基因序列在基因組DNA的結(jié)構(gòu)分析證明，該序列沒有內(nèi)含子。利用綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)核定位分析，目前己克隆出的序列前缺少含有起始密碼子的一段序列。 蘆薈是較重要的一種亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物，具有藥用價(jià)值、美容功效和食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。隨著蘆薈產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，蘆薈產(chǎn)量的要求也越來越高。然而蘆薈抗旱不抗寒，不利于蘆薈的大規(guī)模種植。由于蘆薈開

5、花不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率極低，無法采用傳統(tǒng)的育種方法來增強(qiáng)其抗逆性，因此需要基因工程的方法對(duì)其進(jìn)行改良。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將提高植物抗寒能力的水稻OsDREB基因轉(zhuǎn)入蘆薈基因組中并得到轉(zhuǎn)基因蘆薈，轉(zhuǎn)化所選擇的載體為PBT(其上含有OsDREB基因和nptⅡ選擇標(biāo)記基因)，受體為庫拉索蘆薈。1500塊左右外植體被農(nóng)桿菌侵染后經(jīng)共培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)，G418篩選培養(yǎng)后，獲得了55棵抗性再生植株，目前已檢測(cè)的12株植株中有2棵PCR結(jié)果呈陽性，初步證