AtPCS1基因的克隆及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、利用植物修復(fù)重金屬污染土壤是一種廉價(jià)并且可行的修復(fù)技術(shù)。大部分已發(fā)現(xiàn)的超富集植物生物量小，限制了其在植物修復(fù)方面的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)借助基因工程手段將重金屬富集、耐受相關(guān)的基因AtPCS1轉(zhuǎn)入生物量大且適應(yīng)性廣的苜蓿中，以期獲得能夠富集重金屬的苜蓿，為今后的工作提供基礎(chǔ)材料。 首先，比較了六種不同基因型苜蓿(阿爾崗金、三得利、隴東、甘農(nóng)一號、大花及天蘭)愈傷組織的形成及分化能力。以葉片為外植體，在含1.0mg/L2，4-D、0.1mg

2、/LKT的B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，將愈傷組織置于無激素的B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株再生。六種不同基因型的苜蓿愈傷形成率均在90％以上，品種對苜蓿愈傷組織形成能力差異并不顯著(P＞0.05)。不同品種苜蓿的分化率并不高(0-42.9％)，其中甘農(nóng)一號分化率最高(42.9％)，品種間分化率存在顯著差異(P＜0.05)。進(jìn)一步比較了甘農(nóng)一號葉片、下胚軸及子葉等不同外植體的分化再生能力，不同外植體分化能力差異不顯著，但是葉片起源的愈傷組織分化時

3、間短，且其叢生芽形成數(shù)量高于下胚軸和子葉。再生芽在B5培養(yǎng)基上成苗并在蔗糖濃度為10g/L的1/2MS培養(yǎng)基上順利生根。從愈傷組織的誘導(dǎo)到分化形成再生苗總共約80-100d。對于我們所選的再生體系，甘農(nóng)一號葉片是適于做苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的理想材料。 通過植物螯合肽同重金屬結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而輸送到液泡中隔離是植物對吸收的重金屬進(jìn)行解毒的重要途徑。植物螯合肽合成酶是植物螯合肽合成途徑的關(guān)鍵酶。通過RT-PCR，克隆擬南芥植物螯合肽合成酶

4、(AtPCS1)基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-AtPCS1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，0.75mMIPTG誘導(dǎo)融合蛋白His-AtPCS1表達(dá)，將其純化后采用皮下多點(diǎn)注射免疫的方法免疫BALB/C小鼠，獲得特異性抗血清?？寡逋兓娜诤系鞍准皵M南芥總蛋白的western-blot結(jié)果表明制備的抗血清具有較高的活性和一定的特異性。為進(jìn)一步研究PCS在植物體內(nèi)的分布及不同組織表達(dá)上的差異性，獲得可用于重金屬污染土壤的生物修復(fù)的