基因組學(xué)分析糞腸球菌益生功能及增殖調(diào)控研究.pdf

1、益生菌能夠維持和改善腸道微生物的平衡并且對(duì)宿主具有多種有益影響，為了能夠發(fā)揮其功能，益生菌要能夠耐受胃腸道的“惡劣環(huán)境”，并能夠定植在腸道中。益生菌的益生性具有菌株特異性，然而目前國(guó)內(nèi)益生菌制劑僅有菌種名稱(chēng)，沒(méi)有菌株的具體功能特性信息和遺傳背景信息，更沒(méi)有菌株的全基因組信息。因此，本研究通過(guò)體外試驗(yàn)和比較基因組學(xué)分析相結(jié)合的方法，對(duì)糞腸球菌菌株的益生性和安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為益生菌制劑的開(kāi)發(fā)奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。本文首先對(duì)分離自傳統(tǒng)乳制品中能

2、顯著抑制致病菌的乳酸菌進(jìn)行了篩選和鑒定，隨后結(jié)合比較基因組學(xué)和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)對(duì)糞腸球菌的潛在益生性和安全性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，最后基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝產(chǎn)物分析對(duì)糞腸球菌有氧呼吸條件下糖代謝途徑的研究結(jié)果優(yōu)化其增殖條件實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。
　　從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到116株乳酸菌，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)篩選得到4株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株。隨后對(duì)這4株菌的酸耐受能力、膽鹽耐受能力和黏附能力進(jìn)行研究，最終確定Enterococcus faecalis L

3、D33可做為潛在的益生菌應(yīng)用，并對(duì)其所產(chǎn)細(xì)菌素進(jìn)行了初步純化，利用Tricine-SDS-PAGE電泳確定其分子量約為10 KDa，且具有相對(duì)較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。
　　以E. faecalis LD33菌株為目的菌株，通過(guò)全基因組測(cè)序獲得其基因組完成圖。隨后比較基因組學(xué)分析表明，其染色體上不但具有同酸耐受性和膽鹽耐受性密切相關(guān)的ATPase、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膽鹽水解酶、環(huán)丙烷脂酰磷脂合成酶以及多個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)的

4、編碼基因，而且還具有同黏附作用相關(guān)的黏附素蛋白、纖連蛋白、細(xì)胞表面蛋白、轉(zhuǎn)肽酶和延長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白編碼基因。此外，還具有一個(gè)由雙組分調(diào)控系統(tǒng)、ABC型抗菌肽轉(zhuǎn)運(yùn)通透酶和細(xì)菌素編碼基因構(gòu)成的細(xì)菌素合成基因簇。這些功能基因恰好能夠與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果E. faecalis LD33的良好酸耐受、膽鹽耐受能力和黏附性以及對(duì)致病菌的抑制作用相互驗(yàn)證。比較基因組分析還發(fā)現(xiàn)E. faecalisLD33的染色體上無(wú)致病性毒力因子的編碼基因且不具備通過(guò)基因島

5、、質(zhì)粒等可移動(dòng)基因元件來(lái)傳播藥物抗性的基本條件，抗生素敏感性測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明其僅對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素及利福平具有抗性，可以作為益生菌來(lái)安全使用。
　　通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵和有氧呼吸代謝條件下的E. faecalisLD33呼吸鏈和糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)E. faecalisLD33呼吸鏈編碼基因?qū)儆诮M成型表達(dá)，與其是否進(jìn)行有氧呼吸代謝無(wú)關(guān)，結(jié)合代謝產(chǎn)物分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)其進(jìn)行有氧呼吸代謝時(shí)，其通過(guò)增加丙酮酸代謝通路和丁酸

6、代謝通路中g(shù)ap、pdh、eutD、ackA、alsS和butA基因的表達(dá)量，降低ldh基因的表達(dá)量來(lái)改變葡萄糖的代謝途徑，使碳水化合物代謝的主要終產(chǎn)物由乳酸變成乳酸、乙酸和乙偶姻，當(dāng)葡萄糖被耗盡之后它能夠通過(guò)代謝其他碳水化合物和氨基酸來(lái)繼續(xù)增殖，從而獲得更高的生物量和極強(qiáng)的長(zhǎng)期存活率?；谝陨限D(zhuǎn)錄組和代謝產(chǎn)物分析結(jié)果對(duì)E. faecalisLD33高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后E. faecalis LD33培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)可以達(dá)