基于耐輻射球菌的生物傳感器的構(gòu)建以及耐輻射球菌draSNF2基因的研究.pdf

1、基于對極端抗輻射細菌--耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans R1)的遺傳改造，我們構(gòu)建了一個實時全細胞生物傳感器來檢測高放射性環(huán)境中的放射性物質(zhì)和遺傳毒物。該系統(tǒng)以可受DNA損傷誘導調(diào)控的關鍵基因--recA基因的啟動子作感受因子，以加強型綠色熒光蛋白(eGFP)作報告因子，利用大腸桿菌與耐輻射球菌的穿梭質(zhì)粒作載體導入到宿主菌耐輻射球菌獲得了生物傳感器菌株DRG300。該菌株可以在recA基因啟動子的引發(fā)下表達e

2、GFP蛋白，從而在488 nm紫外線激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。根據(jù)耐輻射球菌活細胞中熒光強度和eGFP蛋白表達量之間的相關性，我們發(fā)現(xiàn)在DRG300菌株中熒光強度同DNA損傷因子比如γ射線和絲裂霉素C(MMC)之間，在一定范圍之內(nèi)存在很顯著的裁量正相關性.同過去一些文獻中報道的全細胞傳感器相比，我們所構(gòu)建的這個重組菌株同時具有廣闊的劑量探測范圍和較高的靈敏度.研究結(jié)果表明，DRG300可作為一個潛在全細胞生物傳感器，基于此構(gòu)建的檢測系統(tǒng)，可以

3、用來實時監(jiān)測環(huán)境中放射性和毒性污染物所造成的生物學危害。 全基因組測序發(fā)現(xiàn)耐輻射球菌中存在大量的未知基因，而借于基因芯片和蛋白質(zhì)組學的研究表明有部分功能未知基因?qū)﹄婋x輻射脅迫有類似RecA的表達譜而表達量比RecA更大，這為尋找recA基因之外的DNA損傷感應因子提供可能?；诖祟怐NA損傷修復相關基因進行構(gòu)建全細胞生物傳感器檢測環(huán)境中的DNA損傷因子，并基于新的熒光報告基因系統(tǒng)，探索功能未知基因的表達特性，我們構(gòu)建了基于ddr

4、A和ddrB基因啟動子PddrA和PddrB的全細胞生物傳感器。通過將啟動子PddrA和PddrB分別同pRADZ3質(zhì)粒融合后，轉(zhuǎn)化入耐輻射球菌R1菌株。利用一種基于β-半乳糖苷酶酶活測定耦聯(lián)熒光素酶活性，構(gòu)建一種有較高靈敏度和穩(wěn)定性，檢測手段更為便捷的全細胞感受器檢測系統(tǒng)。并通過電離輻射和MMC下檢測菌株的發(fā)光特性，揭示了ddrA和ddrB在表達方式上同recA差異的證據(jù)。 針對耐輻射球菌的Snf2家族成員DraSNF2，我們

5、通過測序，確認了DR1258和DR1259組成了一個完整的ORF，編碼一個Snf2家族蛋白。我們分析了此蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)去除內(nèi)含肽的DraSNF2同Snf2家族中的SSO1653亞家族成員有很高的同源性，而與Snf2其他亞家族蛋白明顯隔離開來。通過與SSO1653亞家族成員中已知結(jié)構(gòu)蛋白的對比，預測了其可能具有的生化特性和生物學功能。通過基因敲除突變，構(gòu)建了draSNF2基因的突變株，經(jīng)過DNA損傷實驗，發(fā)現(xiàn)draSNF2對耐輻射