基于耐輻射球菌的生物傳感器的構建以及耐輻射球菌draSNF2基因的研究.pdf

1、基于對極端抗輻射細菌--耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans R1)的遺傳改造，我們構建了一個實時全細胞生物傳感器來檢測高放射性環(huán)境中的放射性物質和遺傳毒物。該系統(tǒng)以可受DNA損傷誘導調控的關鍵基因--recA基因的啟動子作感受因子，以加強型綠色熒光蛋白(eGFP)作報告因子，利用大腸桿菌與耐輻射球菌的穿梭質粒作載體導入到宿主菌耐輻射球菌獲得了生物傳感器菌株DRG300。該菌株可以在recA基因啟動子的引發(fā)下表達e

2、GFP蛋白，從而在488 nm紫外線激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。根據(jù)耐輻射球菌活細胞中熒光強度和eGFP蛋白表達量之間的相關性，我們發(fā)現(xiàn)在DRG300菌株中熒光強度同DNA損傷因子比如γ射線和絲裂霉素C(MMC)之間，在一定范圍之內存在很顯著的裁量正相關性.同過去一些文獻中報道的全細胞傳感器相比，我們所構建的這個重組菌株同時具有廣闊的劑量探測范圍和較高的靈敏度.研究結果表明，DRG300可作為一個潛在全細胞生物傳感器，基于此構建的檢測系統(tǒng)，可以

3、用來實時監(jiān)測環(huán)境中放射性和毒性污染物所造成的生物學危害。 全基因組測序發(fā)現(xiàn)耐輻射球菌中存在大量的未知基因，而借于基因芯片和蛋白質組學的研究表明有部分功能未知基因對電離輻射脅迫有類似RecA的表達譜而表達量比RecA更大，這為尋找recA基因之外的DNA損傷感應因子提供可能。基于此類DNA損傷修復相關基因進行構建全細胞生物傳感器檢測環(huán)境中的DNA損傷因子，并基于新的熒光報告基因系統(tǒng)，探索功能未知基因的表達特性，我們構建了基于ddr

4、A和ddrB基因啟動子PddrA和PddrB的全細胞生物傳感器。通過將啟動子PddrA和PddrB分別同pRADZ3質粒融合后，轉化入耐輻射球菌R1菌株。利用一種基于β-半乳糖苷酶酶活測定耦聯(lián)熒光素酶活性，構建一種有較高靈敏度和穩(wěn)定性，檢測手段更為便捷的全細胞感受器檢測系統(tǒng)。并通過電離輻射和MMC下檢測菌株的發(fā)光特性，揭示了ddrA和ddrB在表達方式上同recA差異的證據(jù)。 針對耐輻射球菌的Snf2家族成員DraSNF2，我們

5、通過測序，確認了DR1258和DR1259組成了一個完整的ORF，編碼一個Snf2家族蛋白。我們分析了此蛋白的保守結構域，發(fā)現(xiàn)去除內含肽的DraSNF2同Snf2家族中的SSO1653亞家族成員有很高的同源性，而與Snf2其他亞家族蛋白明顯隔離開來。通過與SSO1653亞家族成員中已知結構蛋白的對比，預測了其可能具有的生化特性和生物學功能。通過基因敲除突變，構建了draSNF2基因的突變株，經過DNA損傷實驗，發(fā)現(xiàn)draSNF2對耐輻射