糞腸球菌對(duì)利奈唑胺低水平耐藥機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腸球菌是造成醫(yī)院感染的主要條件致病菌，利奈唑胺對(duì)其具有良好的抗菌活性。然而隨著利奈唑胺的廣泛使用，現(xiàn)已出現(xiàn)了對(duì)利奈唑胺耐藥的腸球菌，利奈唑胺對(duì)治療腸球菌造成的感染已面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前腸球菌利奈唑胺耐藥已明確的耐藥機(jī)制包括23S rRNA核糖體突變、核糖體蛋白L3，L4突變以及由多重耐藥cfr基因造成的利奈唑胺耐藥，然而有相當(dāng)數(shù)量的利奈唑胺低水平耐藥腸球菌缺乏明確的耐藥機(jī)制。為探討該類(lèi)腸球菌的耐藥機(jī)制，本研究首先對(duì)此類(lèi)低水平耐藥糞

2、腸球菌采用利奈唑胺進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察該類(lèi)耐藥腸球菌是否能在利奈唑胺體外誘導(dǎo)下產(chǎn)生高水平耐藥，隨后進(jìn)一步深入探索利奈唑胺低水平耐藥機(jī)制，為完善利奈唑胺耐藥研究，發(fā)現(xiàn)新的耐藥靶標(biāo)提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：收集5株耐藥機(jī)制不明的利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌，對(duì)其進(jìn)行利奈唑胺體外誘導(dǎo)，觀察耐藥菌MIC值的變化。隨后采用PCR方法擴(kuò)增誘導(dǎo)菌23S rRNA核糖體V區(qū)及L3，L4核糖體蛋白是否發(fā)生突變，測(cè)序結(jié)果與利奈唑胺敏感野生株ATCC292

3、12進(jìn)行對(duì)比分析。誘導(dǎo)菌 V區(qū)的 G2576T突變及突變拷貝數(shù)則采用限制性?xún)?nèi)切酶酶切及PCR擴(kuò)增和測(cè)序方法檢測(cè)。采用結(jié)晶紫染色生物膜半定量試驗(yàn)分析耐藥菌生物膜形成能力；用 HPLC/UV對(duì)耐藥菌利奈唑胺攝入量進(jìn)行分析；采用4種常見(jiàn)外排泵抑制劑，包括利血平、羰基氰氯苯腙、維拉帕米及蘭索拉唑?qū)δ退幘赡艽嬖诘耐馀畔到y(tǒng)進(jìn)行抑制分析；透射電鏡觀察耐藥菌細(xì)胞壁厚度的變化。
　　結(jié)果：通過(guò)利奈唑胺體外持續(xù)誘導(dǎo)，5株耐藥菌誘導(dǎo)后MIC值較原菌株

4、獲得了8~32倍增加，最高M(jìn)IC值超過(guò)256 mg/L；其中有3株菌23S rRNA的V583區(qū)域發(fā)生了G2576T突變，其余2株菌未發(fā)現(xiàn)V區(qū)突變；所有誘導(dǎo)菌均未發(fā)現(xiàn) L3，L4核糖體蛋白氨基酸突變。MIC值為16 mg/L的耐藥菌比MIC為8 mg/L的耐藥菌以及ATCC29212具有更強(qiáng)的生物膜形成能力；4種外排泵抑制劑使用前后耐藥菌利奈唑胺MIC值無(wú)明顯改變；透射電鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞壁厚度顯示利奈唑胺耐藥菌與敏感菌之間細(xì)胞壁厚度無(wú)明顯