PML NBs新組分分子鑒定及其在DNA損傷反應(yīng)中的功能機(jī)制研究.pdf

1、基因組的完整性是一切生命遺傳和代謝的基礎(chǔ)。DNA損傷反應(yīng)(DNA damageresponse)機(jī)制在維持基因組穩(wěn)定性中起著決定性的作用。DNA損傷反應(yīng)是生物在長期進(jìn)化中發(fā)展的一整套防御系統(tǒng)，它包括損傷監(jiān)視、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、周期調(diào)控、損傷修復(fù)、凋亡誘導(dǎo)等細(xì)胞生物學(xué)事件，是保證機(jī)體自穩(wěn)平衡(homeostasis)的重要機(jī)制，是遺傳性疾病、衰老、腫瘤等醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)領(lǐng)域的核心內(nèi)容之一。與核基質(zhì)相連的，以早幼粒白血病突變蛋白(the promyeo

2、cytic leukemia protein,PML)為核心分子組裝而成的多蛋白復(fù)合物PML核體(PML nuclear bodies，PML NBs)，能作為DNA損傷的動(dòng)態(tài)感受器(dynamic sensors)，通過其組份的組裝(assemble)和去組裝(disassemble)協(xié)同調(diào)控DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡等信號(hào)途徑，是維持基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵多蛋白復(fù)合物之一，對(duì)其功能及調(diào)控機(jī)制的研究不僅能夠推進(jìn)對(duì)DNA損傷反應(yīng)

3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，更可為以PML途徑相關(guān)信號(hào)分子為靶的抗腫瘤治療策略提供理論指導(dǎo)。
　　 正是鑒于PML和PMLNBs在電離輻射誘發(fā)的DNA損傷反應(yīng)中的重要作用及其組份高度動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)，我們采用免疫共沉淀的方法比較了未照射和10Gy照射后6小時(shí)的乳腺癌腫瘤細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中PML結(jié)合蛋白的變化，而后選取差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，以尋找能定位到PMLNBs中并可能在IR誘發(fā)的DNA損傷反應(yīng)中具有重要功能作用的分子。最終我們鑒定

4、得到了124個(gè)潛在的PMLNBs定位蛋白質(zhì)，并驗(yàn)證得到4個(gè)之前未有報(bào)道的，能在電離輻射前后差異定位到PMLNBs的分子(NPM1、MVP、G3BP1、DHX9)。在以上研究的基礎(chǔ)上選取與基因組穩(wěn)定性密切相關(guān)的核磷蛋白(Nucleophosmin，NPMl/B23)分子進(jìn)行進(jìn)一步研究，以探討NPMl-PML相互作用及其在輻射誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制和功能意義。主要研究進(jìn)展如下：
　　 一、PMLNBs的功能蛋白質(zhì)組學(xué)分析<

5、br>　　 1．建立輻射激活PML NBs的細(xì)胞模型。檢測了多個(gè)腫瘤細(xì)胞中PML的表達(dá)，選擇PML表達(dá)量高的MCF-7細(xì)胞作為本研究的細(xì)胞模型；采用免疫熒光的方法實(shí)時(shí)觀測了輻照后不同時(shí)間點(diǎn)MCF-7細(xì)胞中PML NBs的動(dòng)態(tài)變化，選擇PML NBs反應(yīng)活躍的照后6h和末照射的MCF-7細(xì)胞作為篩選輻照相關(guān)PML NBs定位分子的細(xì)胞模型
　　 2．采用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜的方法分離鑒定了IR致DNA損傷反應(yīng)中PML的相互作用候選分

6、子，并建立了一套相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)體系，分別從免疫沉淀的特異性、候選分子生物學(xué)功能以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索分析三個(gè)方面對(duì)候選分子與靶蛋白之間的相互作用進(jìn)行可靠性評(píng)價(jià)。
　　 3．選出NPM1、G3BP1、SNDI、DHX9、及MVP等5個(gè)可信度高的候選分子，采用Co-IP和免疫熒光的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證它們與PML的相互作用，其中NPM1、G3BP1、DHX9及MVP4個(gè)為陽性，進(jìn)一步表明所獲數(shù)據(jù)具有較高的可靠性。數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析為揭示PML

7、NBs的生物學(xué)功能及作用機(jī)制提供了有價(jià)值的線索。
　　 二、RML與NPM1相互作用在DNA損傷反應(yīng)中的動(dòng)能及調(diào)控機(jī)制研究
　　 1．研究NPMI在DSBs(Double stand breaks)損傷反應(yīng)中的功能意義。在γ射線誘發(fā)的DSBs損傷反應(yīng)中，NPM1蛋白在輻照后24h表達(dá)增高明顯，其定位出現(xiàn)從核仁到核漿的擴(kuò)散，與此相對(duì)應(yīng)，MCF-7細(xì)胞在輻照后24h呈現(xiàn)G2/M期細(xì)胞顯著增多；提示，NPM1的蛋白表達(dá)及定位改

8、變可能參與細(xì)胞G2/M阻滯(arrest)調(diào)控。
　　 2．NPM1敲低增高M(jìn)CF-7細(xì)胞的輻射敏感性，NPM1在IR誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮著促進(jìn)DSBs損傷修復(fù)，促進(jìn)G2/M阻滯和抗輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。γ-H2AX免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，敲低NPM1表達(dá)后能夠明顯延緩電離輻射所致的雙鏈斷裂損傷修復(fù)；細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，NPM1敲低后G2/M阻滯顯著降低，文獻(xiàn)報(bào)道，在UV誘發(fā)的SSBs(Single strand breaks

9、)損傷反應(yīng)中，NPM1敲低導(dǎo)致G2/M阻滯升高；提示，NPM1可能通過不同的分子機(jī)制調(diào)控DSBs、SSBs損傷反應(yīng)；細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，NPM1敲低后，細(xì)胞在輻照后24h開始凋亡顯著增加。
　　 3．研究發(fā)現(xiàn)PML參與介導(dǎo)輻射反應(yīng)中NPM1調(diào)控細(xì)胞G2/M期阻滯及凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。敲低NPM1導(dǎo)致PML的表達(dá)升高，caspase3激活，凋亡增加；同時(shí)p21下調(diào)，輻射誘導(dǎo)的G2/M阻滯降低；雙敲低NPM1和PML則可部分地恢復(fù)敲低NP

10、M1誘發(fā)的細(xì)胞G2/M期阻滯減少和凋亡增加，同時(shí)，caspase3激活受到抑制，但p21的表達(dá)依然下調(diào)。結(jié)果表明，輻射誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)中，NPM1的上調(diào)不僅能通過抑制PML(PML-IV)---caspase3信號(hào)途徑抑制細(xì)胞凋亡，還同時(shí)能調(diào)控PML(PML-IV)---caspase3信號(hào)途徑以外的其他凋亡誘導(dǎo)途徑；對(duì)于輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞G2/M阻滯，敲低PML表達(dá)對(duì)NPM1敲低造成的G2/M期阻滯減少的逆轉(zhuǎn)并非通過PML調(diào)控p53下

11、游分子p21的途徑實(shí)現(xiàn)，PML下調(diào)可通過p21非依賴途徑激活G2/M阻滯。
　　 4．免疫熒光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示在照射后6小時(shí)，NPM1和PML存在明顯的共定位。交互的CoIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)NPM1和PML在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用，GST-pulldown實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，體外PML和NPM1也存在直接的相互作用，NPM1與PML相互作用的區(qū)段位于NPM1的N端l-ll7aa，而PML與NPM1相互作用的區(qū)段位于PML的1-360aa的RB

12、CC結(jié)構(gòu)和394-433aa。
　　 5．NPM1通過促進(jìn)PML的泛素-蛋白酶體途徑降解負(fù)調(diào)控PML表達(dá)。NPM1過表達(dá)能夠明顯抑制PML的表達(dá)，同樣抑制NPM1的表達(dá)能夠增加PML的表達(dá)，表明NPM1可以負(fù)調(diào)控PML的表達(dá)水平；泛素-蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制NPM1對(duì)PML蛋白表達(dá)的下調(diào)，表明NPM1能通過促進(jìn)PML的泛素-蛋白酶體途徑降解負(fù)調(diào)控PML表達(dá)。
　　 綜上，本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選獲得一系列γ

13、，射線致DNA損傷反應(yīng)中PML的相互作用候選分子，是迄今為止檢索到的最大規(guī)模的對(duì)PML NBs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，該數(shù)據(jù)對(duì)推進(jìn)PMLNBs在DNA損傷反應(yīng)中的功能機(jī)制研究具有重要意義。同時(shí)，首次系統(tǒng)研究了新鑒定的PML相互作用分子NPM1在DSBs反應(yīng)中的功能作用及其調(diào)節(jié)PML表達(dá)的分子機(jī)制。本研究不僅深化了對(duì)PMLNBs參與DNA損傷反應(yīng)的功能機(jī)制的認(rèn)識(shí)，更揭示了NPM1調(diào)控PML參與細(xì)胞周期及凋亡調(diào)控的新信號(hào)途徑，預(yù)示其具有更為重要的