參與DNA損傷應(yīng)答的果蠅miRNA的系統(tǒng)鑒定及其調(diào)節(jié)凋亡功能的初步研究.pdf

1、維持基因組的穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞和組織發(fā)揮正常功能至關(guān)重要[1]。每天，人體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞在內(nèi)源和外源因素作用下可發(fā)生多至105個(gè)DNA損傷。為了應(yīng)對(duì)這些損傷，機(jī)體進(jìn)化出復(fù)雜的系統(tǒng)來識(shí)別DNA損傷，停止細(xì)胞周期進(jìn)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝，修復(fù)DNA損傷，并在損傷不能修復(fù)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡等。這一系列信號(hào)調(diào)控通路被稱為DNA損傷應(yīng)答通路[2,3]。如果DNA損傷不能及時(shí)、正確的被修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致堿基突變或染色體的畸變，并最終導(dǎo)致腫瘤等惡性疾病的發(fā)生。嚴(yán)重的

2、DNA損傷也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞的衰老。在DNA損傷應(yīng)答調(diào)控中，許多DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白可以被磷酸化、泛素化、蘇素化、甲基化和乙?；刃揎椪{(diào)節(jié)[4,5]。除了多種酶對(duì)DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的修飾調(diào)節(jié)外，DNA損傷后，非編碼 RNA包括微小非編碼 RNA(miRNAs)和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(lncRNAs)也可以通過對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)參與 DNA損傷應(yīng)答[6]。miRNA是一類長(zhǎng)度在22個(gè)核苷酸左右的非編碼RNA。早期研究指出，敲低

3、miRNA生成和功能發(fā)揮必須的dicer基因和ago2基因后，DNA損傷后細(xì)胞的生存率和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)阻滯水平會(huì)顯著降低[7,8]。miRNA發(fā)揮功能的主要方式是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因mRNA結(jié)合，從而導(dǎo)致靶基因mRNA降解或mRNA翻譯終止。DNA發(fā)生損傷時(shí)，miRNA可以直接調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程，也可以通過調(diào)節(jié)包括p53、E2F在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程。
　　本研究收

4、取了野生型果蠅w1118與p53突變果蠅p535A-1-42-4小時(shí)胚胎，使用4 Gy輻照處理，提取總RNA，寄送公司進(jìn)行RNA-seq分析差異表達(dá)的miRNA。通過該策略，共鑒定發(fā)現(xiàn)了44個(gè)差異表達(dá)的miRNA；使用qPCR方法，U6 RNA作為內(nèi)參，對(duì)隨機(jī)選出10個(gè)miRNA，包括6個(gè)上調(diào)的miRNA（miR-263b，miR-137，miR-34，miR-375，miR-987，miR-284）和4個(gè)下調(diào)的miRNA（miR-10

5、02，miR-2b-2，miR-7，miR-3）的RNA-seq結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示 qPCR結(jié)果與 RNA-seq結(jié)果趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)RNA-seq結(jié)果真實(shí)可信。由于超過70%的果蠅miRNA已建立突變動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)室由Bloomington果蠅株共享中心獲得了30株miRNA突變的果蠅株，對(duì)其中的19株純合存活果蠅進(jìn)行了 DNA損傷敏感性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，10株miRNA突變果蠅對(duì)DNA損傷敏感，2株抵抗，7株與野生型果蠅沒

6、有差異。使用caspase-3染色，對(duì)10株輻照敏感的miRNA突變果蠅的翅膀胚芽組織（Wing Disc）進(jìn)行檢測(cè)，觀察miRNA突變對(duì)DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻照導(dǎo)致7株 miRNA突變果蠅的凋亡水平顯著提升。使用分析軟件 microRNA（http://www.microrna.org）和 TargetScan（http://www.targetscan.org）對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)果蠅促凋亡基因家